三重四极杆液质联用仪基础知识和食品安全中的应用.ppt

1、三重四极杆液质联用仪基础知识和食品安全中的应用,液相色谱质谱联用,内容,第一部分 LCMSMS质谱基础知识 第二部分 使用和维护 第三部分 应用实例,第一部分 质 谱 基 础,质谱仪的组成部分,真空系统（分子涡轮泵和机械泵）,大气压,Quadropole Ion Trap TOF Magnetic FT-ICR Obitrap,打拿级 电子倍增器,电喷雾离子化 ESI 大气压化学离子化APCI 大气压光离子化 APPI,离子化接口,液质联用的主要困难,离子源（API大气压电离技术）,离子源作用： 将导入质谱仪系统的样品去溶剂化 将离子源处的大气压与质谱仪系统一级真空阻隔开 被分析物离子化或将溶

2、剂中的离子转化成气相 去除中性物质和带反极性电荷离子，否则会对分析 产生干扰 离子源类型： 电喷雾电离（ESI） 大气压化学电离（APCI） 大气压光电电离（APPI）,离子化方式,离子化方式,硬电离,Soft,碎片信息,API,EI,CI,API（大气压离子化）,软电离,无或很少碎片信息,电喷雾电离(ESI)基本原理,离子传输毛细管,ESI 针,+/- 3kV,喷雾口,溶剂挥发离子脱溶剂化,大气压,液滴,小液滴,离子簇和不同离子族,离子,Ray Limit10cm2/V,第一步：离子的产生,待测物质在溶液中的状态（溶液化学）,B+RCOOH,BH+RCOO-,HA+NH3,A-+NH4,有机

3、碱,有机酸,第二步：雾化,第三步：去溶剂化,第四步: 离子从溶剂的解吸附（气相离子的产生）,为了把 ESI 灵敏度最大化，使用挥发性的缓冲液，不形成离子对。,电荷密度 10(8) V/cm,Auxiliary Gas辅助气,Sheath Gas鞘气,5kV,ESI 喷嘴横截面,喷嘴,喷针,ESI,大气压化学电离 (APCI),通过电晕放电离子化 大气压化学电离有三个过程 1. 在放电电极电晕放电作用下，氮气载气和气化的液相色谱溶剂发生反应，产生预反应离子。 O2 + e- O2+. + 2e- N2 + e- N2+. + 2e- 2. 通过一系列复杂反应，预反应离子与溶剂分子反应形成溶剂离子

4、 H3O+和CH3OH+ 3. 溶剂离子与被分析物分子反应，在正电离模式下，形成正的分子离子；在负的电离模式下，形成负的分子离子 H3O+ + Analyte (Analyte + H)+ + H2O OH- + Analyte (Analyte H)- + H2O, 2004 Dr. Paul Gates, University of Bristol,大气压化学电离 (APCI),APCI 探针,离子传输毛细管,APCI探针,电晕针,离子传输毛细管,离子源接口,大气压光电离 (APPI),通过APCI探头去溶剂化、气化 借助紫外光灯源离子化 电离过程分两步 ： 1. 被分析物质与紫外光源发生

5、相互作用（氪灯发射10.0到10.6电子伏特的光子）。如果被分析物质的电离势能（IP）小于光子能量，那么被分析物质被电离成分子离子 M + hv M+ + e- 2. 如果在质子溶剂介质中，分子离子会接受质子而形成M+H+离子 M+ + S M+H+ + S-H,PAHs APPI 质谱图,离子源选择 (需要考虑的化学因素),ESI (H-ESI): 离子在液态中形成 (Ions formed by solution chemistry?) 对热不稳定化合物首选 (Good for thermally labile analytes) 对极性或半极性化合物首选 (Good for polar

6、/ semi-polar analytes) 可形成多电荷离子分析蛋白质、多肽等大分子物质 （Good for large molecules (proteins / peptides) APCI/APPI: 离子从气态中形成（Ions formed by gas phase chemistry） 对易挥发、热稳定的化合物首选（Good for volatile / thermally stable） 对弱极性或半极性化合物首选 （Good for non-polar / semi-polar） 只可形成单电荷离子，可分析小分子化合物 （Good for small molecules (st

7、eroids) APPI对化学结构中有共轭双键的化合物分析有利 （Good for ions containing a chromophore (APPI),大气压下离子化适用范围,质量分析器类型,四级杆质量分析器 (Quadrupole Mass Analyser) 离子阱质量分析器(Ion Trap Mass Analyser, IT) 飞行时间质量分析器(Time Of Flight Mass Analyser, TOF) 傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance，FT-ICR) 静电场轨道阱质量分析器（Orbi

8、trap）,四极杆分析器,四级杆稳定区域,APEX (0.706, 0.23699),Mathieu 方程,Full Scan -不同质量离子的稳定区间,RF,DC Scan Line,四极杆扫描模式,SCAN模式 假设周期0.1s，则扫描速率为5000 amu/s,SIM模式 同时检测3个离子。假设周期0.3s，则花在每个离子上的时间分别是0.1s。,四级杆质量分析器 (Quadrupole Mass Analyser),理想的四极场为双曲线型，但加工的困难，往往用四根杆代替。 Thermo获得专利的HyperQuad技术，实现真正的双曲线静电场,四极质谱结构简单，价廉，体积小，易操作，无磁

9、滞现象，扫描速度快，灵敏度高，适合于GC-MS, LC-MS。分辩率不高。,Lecture 2.1,29,串联质谱,（QQQ）,TSQ三重四极杆的仪器结构,Ion Max离子源 HESI-II/APCI 吹扫挡锥 可加热的金属离子传输管 T-lens和Skimmer（Quantum系列） S-lens（Vantage) 离子透镜组件 Q0和Q00 质量分析器 Q1和Q3四极杆 Q2碰撞池 检测系统 打拿极 电子倍增器,离子源,离子透镜,质量分析器,检测系统,信噪比改善，更丰富的结构信息,我们为什么做串联质谱,信号,噪声,信造比,分析的级数,Intensity,TSQ三重四极杆质谱的扫描模式,全

10、扫描(Scan),Q1全扫描模式,Q1扫描,仅用射频,Q3仅用射频,选择离子扫描(SIM),目的: 对特定离子进行扫描（定量）,Q1设定,仅用射频,Q3仅用射频,选择反应监测 （SRM),目的：对子离子进行定量扫描,Q2 Q1 Set RF Only + Ar Q3 Set,Q1 Q3 Transition,二级子离子全扫描,目的：对特定母离子的碎片离子进行全扫描,设定Q1,射频和氩气,Q3扫描,母离子扫描 (PS),目的：检测产生特定碎片离子的母离子,Q1扫描,射频氩气,设定Q3,中性丢失扫描（二级质谱扫描）,目的：化合物种类识别，例如磷酸化类化合物,Q1扫描,射频氩气,Q3扫描,TSQ三重

11、四极杆质谱的特点及应用领域,食品安全,环境监测,临床法医毒物分析,药物研发,转换打拿极,正离子（或负离子）被推向转换打拿极。 因此, 会抛射出成比例的反电荷的离子束，包括电子。 转换打拿极固定工作电压 - 15 kV (正离子模式) +15 kV (负离子模式),电子倍增器,第二部分,使用和维护,流速 柱内径 1.0 mL/min 4.6 mm 0.5 mL/min 3.0 mm 0.2 mL/min 2.1 mm 50 mL/min 1.0 mm,色谱柱和流速的选择,长度 内径 粒径 流速 作用 EASY-Column, 2cm, ID100m, 5m 3L/min 捕集柱 EASY-Col

12、umn, 10cm, ID75m, 3m 300nL/min 分析柱,常规色谱柱,微流和纳流色谱柱,流动相添加剂,酸性物质 不推荐使用无机酸（会导致源腐蚀） 推荐使用甲酸和乙酸 碱性物质 不推荐使用金属碱性化合物（会导致源腐蚀） 推荐使用铵及氨水。 表面活性剂 洗涤剂和其他表面活性剂会抑制离子化 三氟乙酸 (TFA) 可以提高色谱分辨率，但无论是正离子化还是负离子化模式，都会抑制离子化 三乙胺/三甲胺 (TEA/TMA) 在负离子化模式下，可以加强去质子化作用。,Buffers 缓冲液,当使用非挥发缓冲液，应该使用吹扫挡锥 如果可能，尽量避免使用非挥发液相色谱添加物质，例如： 碱金属磷酸盐 硼

13、酸盐 柠檬酸盐 如果使用缓冲盐，应该经常清洗离子传输管和Q00。,改善色谱分离 离子对试剂,液质联用添加剂与缓冲液总结,Acetic Acid (0.1 %, v/v) Formic Acid (0.1 %, v/v) Ammonium Hydroxide Ammonia Solutions Trichloroacetic Acid ( 0.02 % v/v) Trifluoroacetic Acid ( 0.02 % v/v) Triethylamine ( 0.02 % v/v) Trimethlyamine ( 0.02 % v/v) Ammonium Acetate (10 mM) A

14、mmonium Formate(10 mM),常用液质流动相,Methanol 甲醇 Acetonitrile乙腈 Water水 Isopropanol异丙醇 Dichloromethane二氯甲烷 Chloroform氯仿 Hexane正己烷,反相RP-HPLC,正相NP-HPLC,气体和溶剂纯度,氮气: High purity (99%) 氮气 气体压力：690 140 kPa (100 20 psi), 0.40.6 MPa 氩气: Ultra-high purity (99.995%)，氩气超高纯(99.995%) 气体压力：135 70 kPa (20 10 psi), 0.15 M

15、pa,Divert Valve切换阀,使用切换阀可以增加API源的耐用性,我们通常在运行分析前将转换阀打开，将流动相转入废液，在分析物质出峰之前提前再转换到分析状态，以便保护检测器,进入离子源,Xcalibur中Divert Valve 切换阀设置,推荐维护日程,每日维护-使用前检查,检查氩气和氮气压力 氮气 : 纯度 (99 %) 压力Gas pressure: 690 140 kPa (100 20 psi), 0.40.6 MPa 氩气 : 超高纯Ultra-high purity (99.995 %) 压力Gas pressure: 135 70 kPa (20 10 psi), 0.

16、15 Mpa 检查离子规压力，确认真空系统处于可操作状态，小于610-6 Torr 3. 移走离子传输毛细管入口上的保护垫或放电针，重新检查前级泵(1.0 2.0 Torr)，和离子规压力，确认真空系统在可操作条件。 4. 检查温度(46)和湿度(40 60 %)； 5. 检查数据系统的磁盘空间,推荐维护日程,冲洗样品管路和大气压电离探针（电喷雾和大气压化学电离）； 设定系统在待机状态； 清洗离子吹扫锥和离子传输毛细管； 设定离子传输毛细管温度200 ; 使用真空隔离垫或者放电针堵上离子传输毛细管口; 废液瓶废液倒掉;,每日维护-使用后维护,如何冲洗样品传输管路等？ （ESI模式下） 按以下步

17、骤设定ESI 参数 设定喷雾电压为0 设定鞘气流速为30 设定辅助气流速为5 设定流动相为水和甲醇50：50，开启液相泵使流动相进入大气压电离源 使流动相流过样品传输管路，以及大气压电离源15分钟 15分钟后，关闭液相的流动相，保持五分钟 5分钟之后，将质谱仪打到待机状态,推荐维护日程,每日维护-使用后维护,推荐维护日程,如何清洗样品传输管线？（APCI模式下） 按以下步骤设定APCI 参数： 设定大气压化学电离源放电电流为0 设定鞘气流速为30 设定辅助气流速5 设定大气压化学电离汽化温度为500 设定液相流动相为水与甲醇50：50溶液，以500 l/min 的流速流入离子源 使流动相流入样

18、品传输管路，大气压电离探针15分钟 15分钟后，关闭流动相，保持五分钟 5分钟后，将质谱仪处于待机状态,每日维护-使用后维护,推荐维护日程,每周维护： 检查机械泵泵油水平线； 如果必要，添加泵油 ； 打开机械泵的排气阀 ，约半个小时； 半个小时候，关闭排气阀；,推荐维护日程,每月维护： 检查氩气罐压力，如果必要更换气瓶 检查TSQ是否需要校正 检查空气过滤器，如果必要应该清洗。 如果泵每天运转24小时，每月有一天要检查：,每三/六个月 - 更换机械泵油。,附 仪器状态指示器,在质谱仪前面板上的右上角装置有6个指示灯,Power,Vacuum,Communication,System,Scan,

19、绿色：供给真空系统和电子组件的电压,灯黄色：涡轮分子泵转速在750 Hz，可以安全打开离子规。 灯绿色：在分析器腔室内的压力在或低于810-6 Torr,黄灯：建立一个通信连接 绿灯：质谱和数据系统通信连接,黄色：MS待机状态 绿色：仪器开机,闪烁兰光：质谱开机运行并扫描,Syringe Pump,绿色注射泵启动 黄色泵达到行程尾端,附 仪器状态指示器,在转换/进样阀上的前面板安装另外两个指示灯,Load,Inject,Detector,Waste,指示灯,进样位置指示,切换位置标签,手动按钮,转换/进样阀按钮和发光指示灯,附 Power Panel电源板,主电源开关,电子服务器开关,真空系统

20、开关,总电源输入,前级泵电源,重启按钮,机械泵,放空阀,以太网,第三部分 应用实例,TSQ三重四级杆质谱仪,食品和饲料中霉菌毒素的检测,LC 0.4mL/min;梯度 进样量：样品10L; M+NH4+ 化合物 涕灭威（Aldicarb) 涕灭威砜 (Aldicarb-Sulfone) 涕灭威亚砜 (Aldicarb-Sulfoxide) 阿维菌素(Avermectin B1a),Accela 600,Flow mL/min:,Pressure bar:,Pulsation:,Delay volume:,Flow Accuracy:,Gradient Accuracy:,Gradient Precision:,0.01 - 5,0 - 600, 0.5 bar amp.,90 uL,+/-