大肠杆菌分子克隆载体课件

1、第三节 大肠杆菌分子克隆载体,1,学习交流PPT,一、E.coli克隆载体的种类 1. 质粒载体复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体质粒载体中插入cos片段，以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。,2,学习交流PPT,二、质粒与质粒载体 1. Ecoli的质粒种类 1) colE1因子（大肠杆菌素因子）多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）

2、,3,学习交流PPT,2.质粒的特点 1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除化学和物理法(吖啶染料，EtBr，高温等) 6) 质粒的整合F因子又可整合到E.coli染色体中 3.质粒DNA的转移 1）质粒DNA的转移过程,4,学习交流PPT,质粒的自主转移过程,5,学习交流PPT,质粒DNA的转移和复制,6,学习交流PPT,2）质粒转移的必备条件 .转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点顺式 作用（cis-action） ii. 细胞附属物性纤毛，由蛋白质构成反式

3、作用 .转移过程所需的全部酶类反式作用 3）质粒转移类型 .自我转移（Self-transmissible） .辅助转移（Donation）可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 .重组转移（conduction）若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。 因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。,7,学习交流PPT,质粒自主转移,质粒的辅助转移,质粒的重组转移,R-

4、重组DNA分子,8,学习交流PPT,4.质粒DNA的复制和调节控制 1) 复制机制复制方向、终止和方式 2) 质粒拷贝数的控制抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。 3)质粒的复制调控机制 例子: ColE1质粒的复制及复制起点结构 Boros etal.(1984)分离到一个pBR322突变体，其拷贝数可达1000/ cell或65%总DNA，原因是在RNAI基因的3端附近发生一次GT颠换。,9,学习交流PPT,ColE1质粒 复制起点结构,质粒DNA的 复制过程,10,学习交流PPT,5.大肠杆菌质粒载体 1) 常用质粒

5、载体的复制子 质粒载体 复制子来源 拷贝数 pBR322系列 pMB1 15-20 pUC系列 pMB1 500-700 pACYC系列 p15A 10-12 pSC101系列 pSC101 25 colE1 colE1 15-20 2) 质粒载体常用的遗传标记基因 Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZ 3) 多克隆位点区 大多数从pUC系列中的多克隆位点衍生出来的,11,学习交流PPT,6.实例pUC18和pUC19 pUC系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个显著特点： 1）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大 2）易于检测是

6、否有外源DNA插入的标记基因LacZ 3）多克隆位点区 .多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列顺序相同，但方向相反。 这种排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入 .产生不同末端规律排列: 两端限制酶位点产生5突起端（EcoRI和Hind），与之相邻的两个限制酶位点产生3突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四个限制酶位点产生5突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收。,12,学习交流PPT,pUC18和pUC19载体,13,学习交流PPT,如插入片段的5段定向缺失: XbaISphIExoS1T4 DNA lingase

7、; 插入片段的3-端亦可采用类似的方法进行缺失（SmaISstIExoS1T4 DNA lingase） 不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又例如: pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)： 假设有一EcoRIHind DNA片段，并要求在其3-末端或5-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子），显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。 . 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源基因 （LacZ启动子）。,14,学习交流PPT,pBS载体的结构,15,学习交流P

8、PT,三.噬菌体载体 1. 噬菌体载体 1）的结构和特点 i. 一般结构：48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t 5-突起（5-GGGCGGCGACCT-3）该末端称为cos位点，可被编码的末端酶所识别（该酶由末端的两个基因Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成） ii. 基因结构46个基因，分为以下四类： ) 调控基因：C、N、CI、Cro、C决定进入溶源化还是裂解状态 ) DNA复制：O、P、Q )重组：int、xis、red和gam )噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J)、S ii.可以低拷贝质粒形式存在于细菌细胞中, 又可以烈性噬菌体形式进行复制; i

9、ii. P1噬菌体包装原理: 渐进满头机制（processive headful mechanism） 底物: 滚环复制过程形成的头尾相连串状体,26,学习交流PPT,包装过程: 始于一个长162bp的P1 pac位点，识别和切割此位点的是P1编码的pacase，切出的pac一端进入预制头部，当其头部充满DNA后，DNA再次被切。第二次切割是随机的，无特异性DNA序列。第二轮包装则从非特异性切割出的末端开始。因此，多次包装都是从一个pac位点开始的。P1头部可容110Kb。 pac位点: 一端含4个六聚体(5 TGATCA/G 3)，另一端则有三个，中间区域长90 bp，pacase切点位于靠

10、近90 bp区的中心序列。每个六聚体都有一个腺嘌呤甲基化位点(damGATC), pacase 只作用甲基化的pac位点.,27,学习交流PPT,大肠杆菌P1噬菌体基因组和包装,28,学习交流PPT,2) P1载体-pAd10 sacB i. 优点 i)可克隆较大插入片段, 可插入95Kb外源DNA，二倍于cos质粒载体 ii)较高的转化频率, 12g载体 + 24g外源DNA105转化子 iii) 与YAC载体相比，它易于产生多拷贝的基因组片段; 易于获得大量特定的克隆DNA; 克隆过程更可靠; 克隆片段易于进行次克隆 ii. 结构 载体被二个loxP重组位点分隔为两区 Ampr和Kanr区

11、 Ampr区：来自pBR322的ori, pac位点(反时针包装), 来自腺病毒的11Kb填充片段(插入到Sca位点) Kanr 区：Kanr(Tn903)和Tetr基因，P1质粒复制子和分离系统，P1裂解复制子，其活性受lac操纵基因启动子控制,29,学习交流PPT,大肠杆菌P1噬菌体载体p Ad10 sacB,30,学习交流PPT,P1噬菌体载体构建 基因组文库的示意图,pAd10 sacB ScaI+BamHI 长臂 + 短臂 加入外源 DNA片段 重组DNA分子 离体包装 感染宿主细胞,31,学习交流PPT,SacB基因:编码一种将蔗糖转化为果聚糖的酶，当含该基因的细胞培养在2%以上蔗

12、糖培养基中时,果聚糖积累在细胞周质空间内，导致大肠杆菌细胞死亡 SacB基因被克隆到原Tetr 基因的BamHI- SalI间,在其上游加上E.coli基因启动子,克隆位点BamHI位于这两个DNA片段间,外源DNA片段插入时可进行显性筛选重组子 为了使sacB基因自发突变减小到最小限度,sacB基因上游还有一个P1 C1阻遏物结合位点与其启动子重叠。凡是表达P1 C1基因的细胞，sacB基因表达受阻，在无蔗糖条件下，这种细胞会生长得更好 iii. 克隆策略 3.3kb短臂：含pac,loxP,无启动子的sacB 26kb长臂: 含P1裂解复制子，Kanr，P1质粒复制子，loxP 位点,32

13、,学习交流PPT,包装: 重组DNA分子先用pacase或抽提物酶切pac位点，然后用抽提物（含头部和尾部）进行包装直至头部充满DNA，最后与尾部相连成有感染力的重组P1噬菌体颗粒。 iV.重组DNA分子形成 当重组DNA分子进入宿主细胞后，特异性位点重组发生在两个方向相同的loxP位点，该过程由宿主细胞表达的重组酶（Cre）催化 v. 宿主菌 E.coli NS3529菌株基因型recA-，lacq，mcrABC，mrr: recA-:防止插入DNA片段内的同源重组，以免发生重排; lacq : 抑制P1裂解复制子的激活, 使P1质粒复制子在细胞中以单拷贝形式存在，亦防止外源DNA分子重排;

14、 mcr和mrr: 抑制富含GpMeC或ApMeC插入片段的选择性丢失,33,学习交流PPT,3. M13和fd载体 1) 结构特征环状ssDNA，病毒颗粒呈丝状 2)复制过程：ss（+） RF(0-1 min) RF RF(0-20 min) RF ss(+)(20 min)DNA包装无严格限制 3) 生活史 a.病毒粒子靠小分子衣壳蛋白和A蛋白附着于性纤毛顶端（E.coli中F因子提供） b. 病毒DNA和A 蛋白进入细胞内，大部分衣壳蛋白则留在细胞膜上 c. 病毒DNA变为双链复制形式（RF）, 衣壳蛋白可能为DNA复制提供附着位点 d.RF进行滚环复制，形成单链，同时基因与蛋白质结合

15、e.ssDNA环化，并形成线状的DNA基因与蛋白质复合物 f.病毒DNA穿膜时，基因与蛋白质被附着于膜上的衣壳蛋白取代，完整病毒从细胞中释放，释放时不杀死细胞，但因感染细胞生长缓慢，仍然可见噬菌斑,34,学习交流PPT,M13噬菌体的生活史,35,学习交流PPT,1）基因结构 基因、和编码特异性蛋白质，参与病毒颗粒的组装 基因参与DNA复制 基因、和编码M13的结构蛋白 基因参与单链复制过程中的环化作用 基因是衣壳蛋白的重要组成部分 2）M13mp系列载体 a.特点：在IR区中插入一个lacZ基因，然后在该基因中逐渐构建一个多克隆位点区，ds-DNA可用常规方法直接导入，ss-DNA常用感染的

16、方法 噬菌斑的形成用于选择DNA导入的细胞，在X-Gal平板上形成的无色噬菌斑检测重组子 b.优点：易于获得ss-DNA用于DNA序列测定和基因突变，从细胞中易于检测分离到RF型的ds-DNA用于外源DNA重组 M13mp系列载体的多克隆位点区,36,学习交流PPT,四. COS质粒载体 1. 结构特点：在普通质粒载体中插入一个或两个来自的cos位点片段, 双cos载体比单cos载体易于重组 l cos位点的精细结构 cos长200 bp，由以下几个亚单位组成： a. cosN由末端酶的gpA亚基识别和切割，产生5-12 n.t突起； b. cosB分别位于cosN的两侧，称之为cosBL（左

17、侧）和cosBR（右侧），为蛋白质结合位点。 R1、R2和R3长16 bp，其中有12个n.t相等，可与gpNul蛋白进行体外结合。 R4与上述三个R片段仅有8个n.t相等，不能与gpNul蛋白进行体外结合，但可以和全酶结合（ATP存在时）。 I1为IHF结合位点。,37,学习交流PPT,COS位点的结构,38,学习交流PPT,2. 优点 . 容量大（可达48 kb），用于基因簇的克隆 . 形成的重组DNA分子可进行体外包装，并能感染E.coli细 胞（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑） . 操作简便，可直接转化细胞 . 对重组DNA分子长度具有选择性包装 3.遗传标记：与质粒载体相同，利用抗生素抗性选择转化子 例子: pJB8和C2XB,39,学