第四章_中药制剂的含量测定

1、中药制剂的含量测定,大纲要求,掌握中药制剂含量测定的目的特点 掌握含量测定样品处理的作用 掌握方法学考察试验内容 熟悉色谱法分离净化样品常用填料及其特点,用适当的化学方法或仪器分析方法对制剂中有效成分或有效部位进行的定量分析。 以其测定结果是否符合药品标准的规定来判断药品的优劣，是控制和评价药品质量的重要方法。,中药制剂含量测定的定义,中药制剂含量测定的特点,中药制剂与化学药品含量测定区别,第一节 含量测定样品的处理,作用： 将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。 除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和准确度。 富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化

2、不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。 使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。,步骤： 样品的粉碎 样品的提取 样品的分离净化,第一节 含量测定样品的处理,目的： 1.保证所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度。 2.加速被测定组分的提取完全。,样品的粉碎,第一节 含量测定样品的处理,注意： 1.避免过细 2.避免样品受污染 3.避免粉尘飞散及挥发性成分的损失 4.避免丢弃不易通过筛孔的部分颗粒 设备：粉碎机、研钵、高速匀浆机、玻璃匀浆器,细粉：全部通过5号筛（80目），并含能 过6号筛（100目）不少于95的粉末,样品的粉碎,第一节 含量测定样品的处理,冷浸法

3、回流提取法 连续回流提取法 超声法 超临界流体提取法,关键提取完全,样品的提取,第一节 含量测定样品的处理,称取一定量样品置于带塞容器内，摇匀后放置，浸泡提取，溶剂用量为样品重量的1050倍，并称重。浸泡时间1224小时，浸泡期间应注意经常振摇。取浸泡后的溶液测定有效成分。,冷浸法,样品的提取,第一节 含量测定样品的处理,浸泡提取法中供试品的制备方式 1.部分测定法（等量法）： 即将浸泡后的溶液，用适宜滤器滤过，精密量取一定体积，进行测定 注：此法不适宜挥发性较大的提取溶剂,冷浸法,样品的提取,第一节 含量测定样品的处理,2.全部测定法（即总量测定法）：将浸泡后的溶液滤过，滤渣充分用溶剂洗涤至

4、提取完全，合并滤液及洗液，浓缩或蒸干，残留物用另一溶剂溶解，定量转入量瓶中，稀释至刻度，摇匀，进行测定 注意： 转移完全,冷浸法,样品的提取,第一节 含量测定样品的处理,灵宝护心丹（牛黄、麝香等）中胆酸的含量测定 取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚 （60-90）4ml，浸泡1小时，滤过，滤渣及滤纸挥去溶剂，放回锥形 瓶中，精密加入冰醋酸无水乙醇溶液（1 10）15ml，摇匀，密塞， 称定重量，浸泡12小时，再称定重量，用冰醋酸无水乙醇溶液（1 10） 补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。,特点 优点：操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少

5、缺点：费时（12-24 h）、费溶剂（10-50倍）,冷浸法,样品的提取,第一节 含量测定样品的处理,将冷浸法中的带塞容器换成回流装置，用单一溶剂或混合溶剂于水浴上加热回流提取，其余操作方法同冷浸法。,万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定 在HCl-70%乙醇溶液，加热回流1h,回流提取法,样品的提取,第一节 含量测定样品的处理,回流提取法,样品的提取,第一节 含量测定样品的处理,1、提取效率高于冷浸法； 2、每次提取时间为0.52小时，直至提取 完全为止。 1、提取杂质较多； 2、不适于对热不稳定或具有挥发性的成分。,优点,缺点,第一节 含量测定样品的处理,样品置索氏提取器中，利用遇热可以挥发

6、的溶剂进行反复提取（相当于总是在使用新鲜溶剂提取），一般提取数小时方可完全。,保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定 +甲醇，加热回流至提取液无色为止,连续回流提取法,样品的提取,优点： 1）无需过滤，提取完全后取下虹吸回流管，就可回收溶剂，再用适宜溶剂溶解，定容，进行测定。 2）提取效率高，所需溶剂少，提取杂质少。 缺点： 受热易分解的成分不宜使用。,第一节 含量测定样品的处理,连续回流提取法,样品的提取,第一节 含量测定样品的处理,样品置适当的容器中，加入提取溶剂，放入超声振荡器（超声波清洗器）中进行提取。一般样品30分钟内即可完成，最多不超过1小时。,保济丸（厚朴等）中厚朴酚测定 +石油醚（30-

7、60），超声处理（功率500W，频率33kHz） 2次，每次30min,超声提取法,样品的提取,优点：超声提取能使样品粉末更好地分散于溶剂中提高提取效率和提取速度。（超声的助溶作用） 缺点：促使化学反应发生（如氧化还原反应、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。,注明超声波的频率、功率，以保证重现性,第一节 含量测定样品的处理,超声提取法,样品的提取,以超临界流体作溶剂的样品提取新技术。,当压力和温度超过气体的临界点时所形成的单一相态,超临界流体特殊的物质状态 密度 液体 溶解能力强 粘度 气体 传质快，有利于待测组分的扩散 表面张力几乎为 0 渗透性好 密度受压力、温度的影响大 改变对溶质的溶

8、解能力,第一节 含量测定样品的处理,超临界流体萃取法（SFE）,样品的提取,最常用的SF是CO2，它的性质稳定，使用安全，价格低廉，临界点低（Tc=31和Pc=7.4MPa），易于操作。 加入甲醇、氯仿、苯等改变极性 提取不同极性的成分,第一节 含量测定样品的处理,超临界流体萃取法（SFE）,样品的提取,SFE具有优点： 速度快 萃取效率高、 选择性较高、 节省溶剂、 可避免使用易燃，有毒的有机溶剂 SFE不仅常用于热不稳定成分或挥发性成分的萃取，而且也越来越多地用于热稳定性成分的萃取。 缺点：对设备要求高。,第一节 含量测定样品的处理,超临界流体萃取法（SFE）,样品的提取,沉淀法 蒸馏法

9、液-液萃取法 A 直接萃取法 B 离子对萃取法 色谱法 消化法,关键保留有效成分,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,原则：从提取液中除去对测定有干扰的杂质，而又不损失被测定成分 依据：被测定成分和杂质在理化性质上的差异，结合测定方法的要求,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,沉淀法,原理：它是基于某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液以得到精制的方法。 这种方法须注意： 1）过量的试剂若干扰被测组分的测定，则应设法除去； 2）大量杂质以沉淀形式除去时，被测成分不应产生共沉淀而损失； 3）被测组分生成沉淀时，其沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定。,复方益母草

10、口服液中水苏碱的含量测定 利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部 分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,蒸馏法,原理：利用某些被测成分具有挥发性,收集馏出液进行含量测定.目前以水蒸气蒸馏法应用较多。 1）可分为共水蒸馏法（即直接加热法）、通水蒸汽蒸馏法和水上蒸馏法。如中药制剂中的挥发油，某些小分子生物碱（麻黄碱、槟榔碱）及丹皮酚等，都可用蒸馏法提取和分离净化。 2）为了使挥发性成分更完全地蒸馏出来，有时也可用盐析作用，即在蒸馏液中加入一定量的无机盐，常用NaCl 、NaSO4、MgSO4等。,例 六味地黄颗粒中丹皮酚含量测定

11、取本品约2g，研细，精密称定，用水蒸汽蒸馏，收集馏出液 约450ml，置500 ml量瓶中，加水稀释至刻度。274nm波长处 测定吸收度。,直接萃取法 原理：利用试样中被测成分与干扰成分在有机溶剂中的溶解度不同，通过多次萃取来达到分离净化的目的。 萃取剂的选择 如苯、氯仿或乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等 多次萃取（3-4次） 调整水相酸度，提取有机酸、有机碱(非离子化),第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,液液萃取法,常用的是有机溶剂直接萃取法和离子对萃取法。,BH+（水相）+ In-(水相) BH+In-（水相） BH+In- （有机相） 适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取（生物碱）

12、水相酸度的控制 离子对试剂的选择,离子对萃取法 原理：在适当pH中，某些有机酸（碱）性物质形成的离子与带相反电荷的离子定量地结合成为弱极性的离子对，易溶于有机溶剂，使之萃取分离。,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,液液萃取法,溴百里酚蓝,溴甲酚绿,分离的原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 凝胶色谱 按操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱 微柱色谱，也称固相萃取或液固萃取（LSE） 柱的大小：长515cm，内径0.51cm,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法,当目标物与填料极性相似时，样品流过柱后，目标物在填料上有较好的保留，而极性与填料相差较远的杂质直接流出，再用

13、适当洗脱液把目标物洗脱、收集，分析；或使杂质保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。,中药制剂教研室,硅胶、氧化铝 键合相硅胶 大孔树脂 聚酰胺 硅藻土、纤维素 离子交换树脂,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法柱色谱常用的填料,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法硅胶、氧化铝,硅胶 作用机制：溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。非极性或极性低的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。 特点：通常适于酸性和中性物质的分离；如分离碱性物质，可在展开剂中加入少量稀碱。,如测定益母草浸膏中总生物碱含量时，使用中性氧化铝柱，以乙醇洗脱生物碱

14、，黄酮类成分则保留在柱上。,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法硅胶、氧化铝,氧化铝 分离机制：溶质在吸附剂表面的极性吸附作用 碱性氧化铝适于碱性和中性物质的分离 酸性氧化铝适于分析酸性和中性物质 中性氧化铝能将黄酮类成份吸附在柱上，可用于生物碱、苷的分离。,八宝坤顺丸 中国药典 2005年版一部，P311,对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30ug的溶液，摇匀，即得。 供试品溶液的制备 取重量差异项下的本品，剪碎，取约2g，精密称定，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，滤过，精密

15、量取续滤液25ml，通过中性氧化铝柱（100200目，2g，内径1cm，用50%甲醇湿法装柱），收集至50ml量瓶中，再用50%甲醇洗脱，收集洗脱液至近刻度，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液10ul与供试品溶液10 15ul，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品每丸含白芍以芍药苷计，不得少于2.6mg。,中药制剂教研室,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法键合相硅胶,借助化学反应方法将固定液的官能团键合在硅胶的表面而构成键合相硅胶。 有机硅烷与硅胶表面化学键合反应，形成的-Si-O-Si-C-键是对溶剂、热和化学稳定的结构。,常用的有十八烷基键合相键

16、合相硅胶（简称C18或ODS）,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法大孔树脂,极性大孔树脂：为丙稀酰胺聚合物，对极性化合物有相对强的吸附力 非极性大孔树脂：为苯乙烯和二乙烯苯的共聚物，对非极性水溶性成分有吸附力 特点：表面积大，传质速率较高，具有不同的极性及适于吸附较大分子,测定复方归芪剂中的黄芪甲苷 用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用30%乙醇洗脱 黄芪甲苷。,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法聚酰胺,机制：主要通过与溶质形成氢键而产生吸附作用 用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离。,测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上聚酰胺柱，水洗去部分杂质， 以95%乙醇洗

17、脱总黄酮后测定。,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法硅藻土、纤维素,亲水性填料 机制：分配作用 应用：多以水基质液为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相，较亲脂的成分从固定相转移到流动相，而被洗脱。,萃取率较高（一般大于80%）， 无浓集作用，但洗脱剂用量较大（一般大于5ml）,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法离子交换树脂,特点：可除去样品中的离子，防止组分分解，用于萃取样品液中可解离化合物 弱酸性药物：中性和碱性条件下用阴离子交换树脂柱，水及有机溶剂洗脱后，酸性溶液洗目标成分,例 益母草流浸膏中盐酸水苏碱的鉴别 取本品10 ml，水浴蒸干，残渣加水10ml使

18、溶解，加稀盐酸调节pH值至12，加在强酸性阳离子交换树脂柱（732Na-型，内径0.9cm，柱长12cm）上，以水洗至流出液近无色，弃去水液，再以2mol/L氨溶液40ml洗脱，收集洗脱液作为供试品溶液。,离子型化合物,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,色谱法离子交换树脂,湿化消化 强酸腐蚀 A 硝酸高氯酸法 B 硝酸硫酸法 C 硫酸-硫酸盐法 干法消化 高温炽灼,测定中药制剂中的无机元素,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,消化法,硝酸-高氯酸法：适用于血、尿、生物组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏，经破坏后所得无机离子均为高价态离子，对含氮杂环类有机物破坏不够完全。 硝

19、酸-硫酸法：适用于大多数有机物质的破坏，无机金属离子均氧化成高价态。与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采用此法。 硫酸-硫酸盐法：经本法破坏所得金属离子，多为低价态。常用于含砷或锑的有机样品的破坏。,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,消化法湿法消化法,第一节 含量测定样品的处理,样品的分离净化,消化法干法消化法,将有机物灼烧灰化以达分解的目的，本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机样品的破坏。 将适量样品置于坩锅中，常加无水Na2CO3或轻质MgO等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。,第一节 含量测定样品的处理,样品

20、的分离净化,消化法干法消化法,应用本法时要注意以下几个问题： 1）灼烧温度在420以下，以免某些被测金属化合物的挥发。 2）检查灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。 3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。,第二节 含量测定方法的验证,分析方法验证的目的 是证明采用的方法适合于相应的检测要求。 需验证的分析项目 鉴别试验、杂质检查、原料药及制剂中有效成分含量测定及其它成分测定 验证内容 准确度、精密度、专属性、线性、范围、耐用性、检测限、定量限、,指

21、用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。用回收率（%）表示。,方法： 回收试验法 加样回收试验法,第二节 含量测定方法的验证,准确度（accuracy）,空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,回收试验（化学药品）,第二节 含量测定方法的验证,准确度（accuracy）,已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,加样回收试验（中药）,第二节 含量测定方法的验证,准确度（accuracy）,规定的范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9次测

22、定结果评价,数据要求,第二节 含量测定方法的验证,准确度（accuracy）,中间浓度加入量与供试品含量控制在1：1 一般要求在95105%范围内 RSD一般在3%以内 准确度应在规定的标准曲线线性范围内建立。,例： 取已知含量的样品(16.361mg/g)6份，每份约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，每份依次精密加入淫羊藿苷对照品溶液(0.3272mg/ml)4、4、5、5、6、6ml，再加甲醇至100ml，照拟定的供试品制备方法制备加样回收供试品溶液，精密吸取10l注入色谱仪中，测定峰面积，按下式计算回收率，结果见下表。,系指在规定测试条件下，同一均匀供试品，经多样取样测定所得结果之间接

23、近的程度。,精密度是考察分析方法在不同的时间、操作人员、实验室，所获得结果之间的重现性和重复性。,在药物分析中，常用相对标准差（RSD）表示。,第二节 含量测定方法的验证,精密度（precision）,偏差（d）： 测量值与平均值之差,标准偏差（SD）,相对标准偏差（RSD） 也称变异系数（CV）,第二节 含量测定方法的验证,精密度（precision）,重复性 (repeatability) 中间精密度（mid-precision) 重现性(reproducibility),第二节 含量测定方法的验证,精密度（precision）,定义： 在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。

24、,要求： 在规定的范围内，取同一浓度的供试品，至少测6次进行评价或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9次测定结果评价,重复性,第二节 含量测定方法的验证,精密度（precision）,取同一批号（20100701）的本品4 ml，精密量取，平行取6份，依法制成供试品溶液，分别量取20l各供试品溶液及对照品溶液注入液相色谱仪测定，计算欧前胡素含量及相对标准偏差，结果见表，表明方法重复性好。,同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。,已有重现性验证， 不需验证中间精密度,重现性只有在该分析方法将 被法定标

25、准采用时做,中间精密度,重现性,第二节 含量测定方法的验证,精密度（precision）,例 精密吸取淫羊藿苷对照品液(23.2g/ml)10l注入液相色谱仪，连续进样5次，测得淫羊藿苷峰面积的相对标准偏差，结果见下表。,指在其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。 反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力； 指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。 常用阴性对照法。,第二节 含量测定方法的验证,专属性（specificity ）,A:阴性对照溶液色谱图； B:欧前胡素对照品溶液色谱图； C:供试品溶液色谱图,第二节 含量测定方

26、法的验证,专属性（specificity ）,第二节 含量测定方法的验证,线性(linearity)与范围(range),设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。,线性的含义,范围的含义,指达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间，表示：mg/Lmg/L,第二节 含量测定方法的验证,线性(linearity)与范围(range),考察方法,线性与范围可通过绘制标准曲线来确定。 n应为57，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r0.999,确定样品浓度与峰面积/峰高是否呈线性关系 确定线性的范围 直线是否通过原点,目的,

27、第二节 含量测定方法的验证,线性(linearity)与范围(range),Y=1292438.5776X+3839.1000,r=0.9998,样品进样量在0.09280.464g范围内，淫羊藿苷峰面积与进样量呈现良好的线性关系。,例： 精密吸取淫羊藿苷对照品溶液(0.0464mg/ml)2、4、6、8、10l注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件进行测定，记录峰面积，测定结果下表。,指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。 如果条件要求苛刻，应在方法中写明,第二节 含量测定方法的验证,耐用性（robustness）,变动因素：测试液的稳定性、样品提取次数、时间 液

28、相色谱法：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类色谱柱、柱温，流速等。 GC法：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体及柱温、进样口和检测器温度等 TLC法：吸附剂或薄层板的型号和厂牌，展开温度、湿度等,柱温变动的影响,耐用性（robustness）,第二节 含量测定方法的验证,流动相组成比例变化的影响,耐用性（robustness）,第二节 含量测定方法的验证,色谱柱的影响,耐用性（robustness）,第二节 含量测定方法的验证,流动相流速的影响,耐用性（robustness）,第二节 含量测定方法的验证,定义 指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。

29、 要求 是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。,检测限（limit of detection， LOD）,第二节 含量测定方法的验证,确定LOD方法 1.直观法：用一系列已知浓度的供试品进行分析，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量 2.信噪比法：把已知低浓度供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度 或注入仪器的量确定检测限,检测限（limit of detection， LOD）,第二节 含量测定方法的验证,是指在保证具有一定准确度和精密度的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的

30、最低量。,常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为101时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。,定量限（limit of quantitation, LOQ）,第二节 含量测定方法的验证,方法 总数 修订 新增 删除 HPLC 339 30 282 0 TLC 32 3 12 12 GC 23 3 19 0 分光光度法 18 0 3 9 滴定法 13 0 3 0 重量法 5 0 1 1 氮测定法 5 1 1 0 挥发油测定法 3 0 0 1 浸出物测定法 13 1 2 1 总计 456 37 327 23,仪器分析法,化学分析法,第三节 常用定量分析方法,化学分析法 可见-紫外分光光度法

31、 薄层扫描法 气相色谱法 高效液相色谱法 荧光分析法 原子吸收分光光度法,第三节 常用定量分析方法,化学分析法所用仪器简单，结果准确。 主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。 化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。 包括重量分析和滴定分析,第三节 常用定量分析方法,化学分析法,重量分析法,挥发法 萃取法 沉淀法 挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分的含量。 如：供试品的干燥失重测定；水分测定均属挥发法；中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。,第三节 常用

32、定量分析方法,化学分析法,萃取法根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的 。 如2000年版药典收载的冰硼散测定冰片的含量： 取本品约2.5g，精密称定，置离心管中，用无水乙醚提取3 次(6ml、3ml、2ml），每次用细玻璃棒搅拌，置离心机中，离心（每分钟转速为3000转）约5分钟，合并上清液，置已称定重量的蒸发皿中，在1525放置1 小时，称定重量，即得。,第三节 常用定量分析方法,化学分析法,重量分析法,沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量的方法 。 如西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定： 取本品60片，精密称定，研细，混匀，取约18g，精密称定，加水150m

33、l，振摇10分钟，离心，滤过，沉淀物用水50ml分三次洗涤，离心，滤过，合并滤液，加盐酸1ml，煮沸，不断搅拌，并缓缓加入热氯化钡试液使沉淀完全，置水浴上加热30分钟，静置1小时，用无灰滤纸或已称定重量的古氏坩埚滤过，沉淀用水分次洗涤，至洗液不再显氯化物的反应，干燥，并炽灼至恒重，精密称定，与0.6086相乘，计算即得。,第三节 常用定量分析方法,化学分析法,重量分析法,滴定分析法,酸碱滴定法 沉淀滴定法 配位滴定法 氧化还原滴定法,第三节 常用定量分析方法,化学分析法,酸碱滴定法,适用于测定中药制剂中所含的生物碱、有机酸、内酯类组分的含量 。 对于KC10-8酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定

34、。 对于KC10-8的弱有机酸、生物碱或水中溶解度很小的酸碱，只能采用间接滴定或非水滴定法测定。,第三节 常用定量分析方法,化学分析法,滴定分析法,例：颠茄酊中生物碱的含量测定,精密量取本品100ml，置蒸发皿中，在水浴上蒸发至约10ml，移至分液漏斗中，蒸发皿用0.1mol/L硫酸溶液10ml分次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用氯仿分次振摇，每次10ml，至氯仿层无色，合并氯仿液，用0.1mol/L硫酸溶液10ml振摇洗涤，洗液并入酸液中，加过量的浓氨试液使呈碱性，迅速用氯仿分次振摇提取，至生物碱提尽。每次得到的氯仿液均用同一水10mL洗涤，弃去水液，合并氯仿液，蒸干，加乙醇3ml，蒸干，并在8

35、0干燥2小时，残渣加氯仿2ml使溶解，精密加硫酸滴定液（0.01mol/l）20ml，置水浴上加热，除去氯仿，放冷，加甲基红指示液12滴，用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴定。每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于5.788mg的莨菪碱。,沉淀滴定法,银量法适用于测定中药中无机卤化物、有机氢卤酸盐及有机卤化物 四苯硼钠法适用于测定生物碱的含量 亚铁氰化钾法,第三节 常用定量分析方法,化学分析法,滴定分析法,配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸铵法。用以测定鞣质、生物碱及含Ca+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量。 如万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵法；牛黄解毒片

36、中石膏的测定。 氧化还原滴定法用于测定氧化还原性物质，酚类、糖类、含Fe、As的中药制剂 。 如磁朱丸中全铁的含量测定采用铈量法；牛黄解毒片中雄黄的测定；丹皮酚注射液中丹皮酚的测定。,第三节 常用定量分析方法,化学分析法,滴定分析法,该法是中药及其制剂含量测定的一种常用方法,具有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。 该法要求被测成分本身或其显色产物对可见紫外光具有选择性吸收。 按测定波长数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。,第三节 常用定量分析方法,可见-紫外分光光度法,单波长光度法,特点：选择被测成分的max为测定波长，而共存组分在此波长处基本无吸收 吸收系数法 对照品比较法 标准曲线法,

37、第三节 常用定量分析方法,可见-紫外分光光度法,例：华山参片中莨菪碱的含量测定,对照品溶液的制备 精密称取在120干燥至恒重的硫酸阿托品，加水制成每1ml相当于含莨菪碱7g的溶液，即得 供试品溶液的制备 取本品40片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量，置具塞锥形瓶内，精密加入枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（PH4.0）25ml，振摇5分钟，放置过夜，用干燥滤纸滤过，取续滤液，即得,测定法 精密量取供试品溶液与对照品溶液各2ml，分别置分液漏斗中，各精密加枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（PH4.0）10ml，再精密加入用上述缓冲液配制的0.04%溴甲酚绿溶液2ml，摇匀，用10ml氯仿振摇提取5分钟，

38、待溶液完全分层后，分取氯仿液，用氯仿湿润的滤纸滤入25ml量瓶中，再用氯仿提取3次，每次5ml，依次滤入量瓶中，并用氯仿洗涤滤纸，滤入量瓶中，加氯仿至刻度。照分光光度法（附录 B）分别在415nm的波长处测定吸收度，计算，即得,供试品溶液中若有多种组分共存，可通过测定多波长处的吸收度，采用适当的数学处理方式进行多组分的同时测定，或者排除共存组分干扰，测定其中的某个组分。 包括双波长法（包括等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。,第三节 常用定量分析方法,可见-紫外分光光度法,多波长光度法,第三节 常用定量分析方法,可见-紫外分光光度法,多波长光度法 等吸收点法,设a、b

39、分别为干扰组分和被测组分，2为测定波长（S），1为参比波长（R）。 选择1和2的两个基本条件： （i）a在1和2处应具有相同的吸收度，即Aa=Aa2- Aa1=0，以便消除a的干扰。 （ii）b的Ab=Ab2- Ab1应足够大，以便提高测定的灵敏度和准确度。通常2选在b的max附近。 定量公式 A = Aa + Ab = Ab =（Eb2 - Eb1 ） L Cb = K Cb 即A与Cb成线性关系，而与干扰组分浓度无关,样品经薄层分离后，用一定波长的光扫描吸收紫外可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，用薄层色谱扫描仪（光密度计）测量被斑点反射或斑点发射的光束强度的变化而定量，可用于药品

40、的鉴别、杂质检查或含量测定。 根据薄层扫描的测定方式分为 薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法 二种方法。,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,薄层吸收扫描法,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,用钨灯或氘灯为光源在波长为200800nm范围内选择合适波长进行测定。,Beer定律 Kubelka-Munk理论 散射参数（SX） SX=0（即薄层固定相无散射作用）时，A与KX呈线性关系，服从Beer定律。 SX0时，透射法的A值随着SX增大而增大，而反射法的A值随SX的增大而减小。,薄层板的 散射现象,用于定量分析时需对曲线进行处理： 曲线较直法：岛津CS系列采用该法。该法特点：需知SX值，根据S

41、X值，将Kubelka-Munk曲线校正为直线。 计算机回归法：Camag仪器采用该法。由计算机根据最小二乘法原理对标准品测定值进行相关分析，得到最佳回归方程。不需要SX值。,薄层吸收扫描法,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,薄层荧光扫描法,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,基本原理：F=KC 光源：氙灯或汞灯。 灵敏度：最低可测到10 50 pg。 适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。 Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。,考察内容： 标准曲线考察 分离度考察 重复性考察 准确度考察,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法

42、,新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察，以说明新建方法的可靠性。,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,适于用Kubelka-Munk曲线校直法进行定量校准的仪器 检查所选择的散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工作曲线被校为直线，否则，调整SX值再校正，直至工作曲线成直线为止。 考察工作曲线是否过原点，以确定采用一点法或二点法定量。 确定点样量的线性范围。即使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、下限。,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,定量峰与相邻峰之间较好分离，分离度（R）应大于1.0,按拟定的含量测定方法，对同一批样品进行多次测定（平行试验至少

43、6次以上），计算相对标准差，RSD应不大于3%。,至少需要6次试验，在供试品中加入纯品，测定其含量。 加样回收率要求在95%105%之间。,回归曲线法 内标法 外标法 外标一点法 外标两点法,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,外标一点法 工作曲线通过原点时可用外标一点法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为： C=F1A 式中：C为组分的重量或浓度，A为测得该组分的峰面积，F1为直线的斜率。,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,薄层色谱扫描最常用的定量方法,外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液

44、（或一种浓度两种点样量），才能决定一直线,其计算公式为： C=F1A+F2 式中：C、A同前，F1为直线的斜率或比例常数，F2为纵坐标的截距，F1和F2值由仪器自动算出。,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,注意事项： 点样量必须准确 宜用定量毛细管点样。 采用随行标准法，即供试品与标准品交叉点在同一板上； 为减小误差 同一薄板上供试品点样不得少于4个，对照品每一浓度不得少于2个； 调整供试品与标准溶液的点样量，使其峰面积相接近；,第三节 常用定量分析方法,薄层扫描法,外标两点法,外标一点法,应用范围 ：主要用于测定含挥发油及其他挥发性组分的含量。气相进样量小,第三节 常用定量分析方法,气相

45、色谱法,理论塔板数n：对柱效高低的评价指标，n高，则柱效高，分离效果好。理论塔板数低于规定值，则要考虑更换色谱柱。 速率理论：说明色谱柱、载气、柱温等对柱效的影响。 分离度R：R1.5时，表明两峰完全分离。 系统适应性实验：理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子等。 实验条件的选择：固定相、柱温、载气等。 定量分析方法：归于化法、外标法、内标法。,优点：可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因所带来的定量分析误差。 缺点：样品的配制麻烦，选择化学结构、物理性质与待测组分相似的纯品作为内标物不易寻找。,气相色谱法,第三节 常用定量分析方法,内标法,内标物的选择原则： 应是样品中不存在的纯物质。加入

46、量应接近于被测成分。其色谱峰应位于被测成分色谱峰附近且与之完全分离。,同一检测器对不同物质具有不同的响应值，故不能用峰面积直接计算的被测成分的含量，要引入校正因子（f ）。 药典中采用的是相对重量校正因子（fw）. 即被测成分单位峰面积所相当的物质量（Mi/Ai）是内标物单位峰面积所相当的物质量（Ms/As）的多少倍。,内标法加校正因子,气相色谱法,第三节 常用定量分析方法,内标法,As,Ci = f Cs,Ai,校正因子经常不知，可采用药典方法测定校正因子再用内标法.,课间习题：十滴水软胶囊中樟脑含量的测定 本品由樟脑、干姜、大黄、小茴香、肉桂、辣椒、桉油等七味中药制成，樟脑是其主成分之一，

47、具升华性，故采用气相色谱法，以樟脑为对照品，薄荷脑为内标物，对其进行含量测定。 色谱条件与系统适用性试验 以聚乙二醇（PEG）-20M为固定相，涂布浓度为10%，柱温150。理论塔板数按樟脑峰计算应不低于2000，樟脑峰与内标物质峰的分离度应大于2。,校正因子测定 精密称取樟脑对照品（r）50mg，置10ml量瓶中，精密加入薄荷脑内标物质(s)50mg，加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取12l，注入气相色谱仪， Ar=211948、As=215835，计算校正因子（保留四位有效数字） 。,测定法 取装量差异项下的内容物，混匀，取0.8g，精密称定0.7956g，置具塞试管中，用无水乙醇提取5次，

48、每次4ml，分取乙醇提取液，合并，转移至25ml量瓶中，精密加入薄荷脑125mg，使溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(is)。精密量取12l，注入气相色谱仪测定， Ai108685、 As123544，计算即得（保留两位有效数字)。,解答问题 本法属于气液分配GC还是气固吸附GC？ 采用的是外标法还是内标法？ 求算樟脑的含量。 (药典规定，本品每粒含樟脑不得少于53mg。),课间习题：十滴水软胶囊中樟脑含量的测定,解： 求算校正因子（f） f = (As / AR) (MR / Ms ) = (215835 / 211948) / (50mg / 50mg) 1.108 求算供

49、试液中樟脑的浓度Ci（mg/ml）,Ci = f Cs = 1.108 X X 5 mg/ml = 6.30 mg/ml,As,Ai,123544,108685,课间习题：十滴水软胶囊中樟脑含量的测定,应用范围：适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。 实验条件的选择：色谱柱的选择、洗脱方式的选择、检测器的选择、HPLC前处理 色谱柱的选择：反相色谱柱 、正相色谱柱、离子对色谱柱,第三节 常用定量分析方法,高效液相色谱法,定量分析方法,外标法 内加法,第三节 常用定量分析方法,高效液相色谱法,课间习题.牛黄解毒片中黄芩的含量测定 本品由牛黄、大黄、黄芩、冰片、石膏等八味中药制成。中国药

50、典以黄芩苷为指标，采用HPLC测定其中黄芩的含量。 （1）色谱条件与系统适应性试验 固定相：用十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相：甲醇-水-磷酸（45550.2），流速1ml/min； 检测器：紫外检测器，检测波长为315nm；理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。 （2）对照品溶液制备 精密称取在60减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，以甲醇溶解配成每1ml中含31.2g的对照品溶液。,（3）供试品溶液制备 取牛黄解毒片20片，剥去糖衣，精密称定6.254g，研细，精密称取1.045g，加70%乙醇30ml，超声处理20分钟，放冷滤过，滤液置50ml量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，

51、洗液滤于同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。 （4）测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l进样，测得对照品及供试品中黄芩苷的峰面积分别为A供4340441，A对3945856。,【解答】 采用的是外标法还是内标法？ 流动相中为什么要加入少量磷酸？ 计算黄芩苷的含量 （保留两位有效数字）。,课间习题. 牛黄解毒片中黄芩的含量测定,求算供试液中黄芩苷的浓度,求算药品中黄芩苷的含量,黄芩苷（mg/片）=,C供稀释倍数平均片重,取样量,=,34.3（g/ml）10ul50ml312.7mg/片,1045mg,=0.51,课间习题. 牛黄解毒片中黄芩的含量测定,思考题,方法学考察内容

52、包括哪几项？ 样品提取分离常见的方法有哪些？ 色谱法的定量分析方法是怎么操作的？,课间习题： 九分散中士的宁的含量测定 九分散是由马钱子粉、麻黄、乳香和没药等制成。马钱子粉中含有士的宁、番木鳖碱等生物碱，具生理活性但也有毒性，故需控制马钱子含量。中国药典规定按干燥品计每包含马钱子以士的宁计应为4.55.5mg。 供试品溶液的制备 取本品10包，混合研匀。精密称取2g置具塞锥形瓶中，精密加氯仿20ml与浓氨试液1ml，轻轻摇匀，称重，于室温下放置24小时，再称重，补足氯仿减失的重量，充分振摇，滤过。精密量取滤液10ml，用硫酸溶液分次提取，至生物碱提尽，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加浓氨试液使

53、呈碱性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，放冷，残渣中精密加氯仿5ml使溶解，作为供试品溶液。,对照品溶液的制备 取士的宁对照品，加氯仿制成每1ml含0.4mg的溶液。 测定法 吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液（161214）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法进行扫描，波长：s=254nm ，R=325nm ，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。已知：AR19663.07， As20617.25，取样量2.098g。 解答问题 采用外标一点法还是外标两点法？ 采用什么方法显色定位？ 计算每包药品中马钱子的含量。（保留两位有效数字）,求出供试品斑点中士的宁的质量 求出供试品中士的宁的含量,Ms = MR X =5 l x 0.4 g/ l x =2.1g,As,AR,19663.07,20617.25,含量（mg/包）=,Ms X 稀释倍数 X 标示重量,取样量,=,0.0021mg X 5ml X 20ml X