病毒性肝炎血清学检测的基础与实践.ppt

1、南京大学医学院,周乙华,附属鼓楼医院 感染科,病毒性肝炎血清学检测的基础与实践,为什么ELISA检测抗体容易假阳性 检测抗体和抗原的基本原理ELISA 病毒性肝炎血清学检测的基础和实践,讲 解 内 容,甲型肝炎 乙型肝炎 丙型肝炎 丁型肝炎 戊型肝炎,4.如何克服抗-HEV检测中的假阳性,为什么ELISA检测抗体容易假阳性?,抗体的粘附特性，特别是IgM抗体,ELISA的高灵敏性,抗体结合抗原的适应性： FabCDR,抗-HIV 初筛试验,抗-HIV 确诊试验,CL,VL,VH,CH1,CH2,CH3,V区,Fab段,Fc段,s-s,s-s,s-s,s-s,CDR1,CDR3,CDR2,抗体结

2、构简图,IgM是五聚体，与抗原具有5或10价结合力。,Fab：fragment antigen-binding,CDR：complementarity determining region,Fab段,抗体结合抗原的适应性： FabCDR,抗体产生过程简图,间接ELISA检测抗体,1. 抗原包被,2. 封闭,3. 待测血清,4. 酶标二抗,5. TMB显色,6. 2M H2SO4,7. OD450,+ Substrate TMB,抗-IgG,抗-IgA,抗-IgM,IgG,IgA,IgM,抗体的粘附特性,0,0.50,1.00,1.50,2.00,原倍,10,100,1000,10000,血清稀

3、释倍数,OD450,间接ELISA，无抗原包被,间接法ELISA检测抗体，灵敏，但容易出现假阳性,捕捉法ELISA检测IgM抗体,1. 抗mu链抗体包被,2. 封闭,3. 待测血清,4. 酶标抗原（特异性）,5. TMB显色,6. 2M H2SO4,7. OD450,敏感性较间接法低，但特异性强,ELISA检测抗原,1. 抗体包被,2. 封闭,3. 待测血清,4. 酶标抗体,5. TMB显色,6. 2M H2SO4,7. OD450,+ Substrate TMB,包被抗体与酶标抗体识别的免疫表位必须不同,病毒性肝炎,甲型,乙型,丙型,丁型,戊型,Hepatitis A Virus, HAV,

4、Hepatitis B Virus, HBV,Hepatitis C Virus, HCV,Hepatitis D Virus, HDV,Hepatitis E Virus, HEV,消化道,血液,消化道,感染途径,血液,血液,病原学,病程分型,急性,急性, 慢性,急性, 慢性,急性, 慢性,急性,GBV-C，所谓庚型肝炎病毒，不引起肝损，不是肝炎病毒,EB病毒、巨细胞病毒等可引起肝损，但以脏器损伤为主，不称肝炎病毒,病毒性肝炎的病原诊断,根据临床表现无法确定病原诊断,依赖实验室检查,血清学方法：血清+免疫技术检测抗原或抗体,分子生物学：,酶免疫测定：enzyme immunoassay, E

5、IA,酶联免疫吸附测定：enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA,分子杂交：同位素或其他物质标记已知DNA或cDNA，即探针，与待测标本中的核酸互补，特异性结合。淘汰,聚合酶链反应：polymerase chain reaction，PCR普遍使用,甲型肝炎病毒 HAV,无包膜RNA病毒：抗原种类少,正链RNA，7.4 kb,HAV抗原只有一种，即衣壳蛋白；难以测到，不开展,特异性抗体：抗-HAV IgG, IgM ，保护性抗体；常用,HAV RNA：RT-PCR检测，但阳性率低，仅用于研究,0,2,4,6,8,10,12,抗甲肝抗体浓度,感染后周数,病

6、毒血症,大便排病毒,转氨酶升高期,症状期,IgM,IgG,HAV感染后人体抗体应答,抗-HAV IgM：感染后3周即可阳性，1-3月后转阴，近期或急性感染。,抗-HAV IgG：IgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG通常不用于诊断。,甲型肝炎诊断流程,同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况,仅检测抗-HAV IgM时,甲型肝炎,甲型肝炎,1.,2.,既往感染，对甲肝有免疫力,排除甲肝，而且为易感者,3.,阳性,阴性,排除,甲型肝炎诊断流程,同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况,甲型肝炎早期 或IgM假阳性,1-2周后复查,甲型

7、肝炎,甲型肝炎,IgM 假阳性 排除甲型肝炎,4.,乙型肝炎病毒 HBV颗粒,完整HBV： Dane particle；球形，42 nm，双层壳膜结构,小球形颗粒：22 nm，乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）,丝状(管状)颗粒：直径22 nm，长短不等，HBsAg,18.7万倍,20万倍,25万倍,HBV双层壳膜结构，外层是HBsAg，内层是HBcAg,HBV基因与基因产物,pre-S1,pre-S2,ORF S,ORF P,ORF X,ORF C,pre-C,+,-,5,5,HBsAg,Polymerase: DNA polymerase

8、RNase H Reverse transcriptase others,HBxAg,HBcAg,HBeAg,pre-S1,pre-S2,HBV主要结构示意图,HBsAg,HBcAg,HBV DNA,HBeAg不是病毒的结构成份,HBV PreC/C基因序列,1814 atgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgtt catgtcctac 1861 tgttcaagcc tccaagctgt gccttggggg gctttgggac atggacattg 1911 accactataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc tttt

9、ttgcct 1961 tttgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct 2011 ctatcgagag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag 2061 cactcaggca agctgttctg tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc 2111 tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcgg 2161 ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgg

10、ggtttc 2211 acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttctaga gtatttggtg 2261 tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc 2311 ccctatctta tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca 2361 ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg 2411 ccgcgtcgca gaagatctaa atctcgggaa tctcaatgtt ag,M

11、QLFHLCLII SCSCPTVQAS KLCLGGLWDM DIDHYKEFGA SVELLSFLPF DFFPSIRDLL DTASALYREA LESPEHCSPH HTALRQAVLC WGELMNLATW VGSNLEDPAS RELVVGYVNV NMGLKIRQLL GFHISCLTFG RETVLEYLVS FGVWIRTPPA YRPPNAPILS TLPETTVVRR RGRSPRRRTP SPRRRRSQSP RRRRSKSRES QC 147-149,HBV Pre C/C 编码 HBcAg/HBeAg,HBcAg: 21.5 kD HBeAg: 15.5 kD,HB

12、V抗原,5,3,5,3,42 nm,HBsAg,HBcAg,HBV DNA,HBeAg,不是HBV本身的成分 是HBcAg的裂解产物 能释放到细胞外 外周血能测到,能释放到细胞外 外周血能测到,不能释放到细胞外 外周血不能测到,外周血无游离HBV DNA 检测时先裂解HBV,HBV示意图,HBV抗原,5,3,5,3,42 nm,HBsAg,HBcAg,HBV DNA,HBeAg,不是HBV本身的成分 是HBcAg的裂解产物 能释放到细胞外 外周血能测到,能释放到细胞外 外周血能测到,不能释放到细胞外 外周血不能测到,外周血无游离HBV DNA 检测时先裂解HBV,HBV示意图,HBV携带者肝脏

13、每天释放101012病毒 血液HBsAg是HBV的1000100000倍,HBV编码抗原特点,HBsAg 抗-HBs,HBsAg+，有传染性 HBsAg+ 和HBeAg+，传染性强,HBsAg -，无传染性，除隐匿性感染或变异外,抗-HBs+，10 mIU/ml，有保护力,HBeAg 抗-HBe,抗-HBc,乙型肝炎病原学检测,HBV DNA 有条件的开展 抗病毒治疗考核疗效,乙肝血清学检测结果的意义,乙肝血清学检测结果的意义,为什么可通过检测外周血抗原诊断HBV感染？,HBeAg能释放到细胞外比较容易测到,HBsAg能释放到细胞外可测到,HBV携带者肝脏每天释放101012病毒 血液HBsA

14、g是HBV的1000100000倍,其他病毒复制过程中，缺乏类似特性，不释放游离抗原，故通常不检测抗原，而通过检测特异性抗体而诊断。,以上原因，决定了诊断HBV感染可通过检测病毒抗原。,容易测到,抗-HBc的意义,抗-HBc IgG：长期存在，阳性时如HBsAg阴性，既往感染,抗-HBc IgM：短期存在，阳性时，通常HBsAg也阳性；见于急性感染或慢性携带者急性发作,实际工作中，抗-HBc阳性具有传染性 基本不正确,抗-HBc IgM具有传染性正确,目前检测的抗-HBc是总抗体，包括IgG、IgM等，只要IgG阳性，抗-HBc即阳性；多数情况下，抗-HBc阳性仅是 IgG抗体阳性。,正确HB

15、sAg阳性具有传染性,HBsAg()HBeAg(+)阳性HBV携带者,HBsAg()HBeAg(+)阳性携带者新的S基因变异,PCR产物测序,克隆后测序,pre S2 gene,HBsAg()HBeAg(+)阳性携带者前S2基因序列,PCR产物测序,克隆后测序,HBsAg()HBeAg(+)阳性HBV携带者,IF 3.124,具有研究价值的HBV标本,*未接种疫苗，即自然感染除外。,丙型肝炎病毒 HCV,HCV 30-60 nm,有包膜的RNA病毒，核心含有核心蛋白和RNA单链正义,HBV,HCV抵抗力弱，且RNA容易降解，检测核酸时，标本需在30分钟内分离血清，-80 C保存。,Lipid

16、layer 脂质层,Core, 核心蛋白,E1, 包膜蛋白1,E2, 包膜蛋白2,RNA, 病毒核酸,直径 30-60 nm,结构蛋白,HCV结构简图,糖基化蛋白,HCV示意图,HCV基因与基因产物,hypervariable region 1, HVR1,Untranslated Region, UTR,Noncoding region, NCR,针对HCV所有抗原的抗体都没有证实有中和作用,HVR1,38 clones 15 sequences,HCV高度变异,HVR1,抗原检测 HCV core: 仅用于研究,抗-HCV IgM：一般不开展，阳性率低,HCV RNA：有条件的开展；抗病毒

17、治疗考核疗效,抗-HCV IgG：开展，(+)通常表示有HCV感染,HCV病原学诊断,针对HCV所有抗原的抗体都没有证实有中和作用,抗-HCV IgM：一般不开展,抗-HCV IgG：开展，90-95的(+)提示HCV感染,HCV病原学诊断抗-HCV检测,包被抗原,1st代,3rd代,2nd代,50-75%,90-95%,95-99%,阳性率,丁型肝炎病毒 HDV,Deltavirus genus中的唯一病毒,HDV, 36 nm,HDV RNA, 1.7 kb,缺陷病毒，必须有HBsAg,HDAg：仅用于研究,抗-HD IgM：()近期感染,抗-HD IgG：()感染,HDV RNA：仅用于

18、研究,HDV病原学检测,仅在HBsAg阳性人群中检测才有意义：,戊型肝炎病毒 HEV,属于family Hepeviridae, genus Hepevirus,HEV, 30-32 nm,无包膜：抗原种类少,新的HEV发现：兔HEV王佑春等,HEV基因及其蛋白,ORF1,ORF3 ？,ORF2,5,3,核衣壳 Capsid,非结构蛋白,结构蛋白,主要抗原决定簇,中和免疫,459,607,核酸：单链正义RNA，7.2 kb,0,2,4,6,8,10,12,14,转氨酶升高期,症状期,IgM,IgG,病毒血症,大便排病毒,抗戊肝抗体浓度,感染后周数,HEV感染后人体抗体应答与HAV类似,抗-HE

19、V IgM：感染后3周即可阳性，1-3月后转阴，近期或急性感染。,抗-HEV IgG：IgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG通常不用于诊断。,HEV抗原：一般不开展，仅用于研究,HEV病原学检测与甲肝类似,抗-HEV IgM：()近期感染,抗-HEV IgG：双份血清,HEV RNA：一般不开展，仅用于研究,HEV病原诊断抗-HEV,同时检测抗HAV IgM和IgG时：4种情况,仅检测抗-HEV IgM时,戊型肝炎,戊型肝炎,1.,2.,既往感染，对戊肝有免疫力,排除戊肝，而且为易感者,3.,阳性,阴性,排除,同时检测抗HAV IgM和Ig

20、G时：4种情况,戊型肝炎早期 或IgM假阳性,1-2周后复查,戊型肝炎,戊型肝炎,IgM 假阳性 排除戊型肝炎,4.,HEV病原诊断抗-HEV,抗-HEV检测试剂质量差异很大(国外),Hepatology 1998;27:857-861.,12种检测方法早期康复期血清抗-HEV滴度,Hepatology 1998;27:857-861.,WB,WB,昆虫,大肠杆菌,合成肽,抗-HEV IgG诊断试剂阳性率比较(国内外),不同试剂检测结果偏差很大，尤其在血清流行病学调查。,中华实验和临床病毒学杂志 2007;21(1):59-61.,抗-HEV IgM,抗-HEV IgG,检测方法存在一定假阳性

21、和假阴性,607-660,ORF2,1-111,458-607,ORF3-E,ORF3-S,1,123,91,123,ORF3,660,1,主要抗原决定簇,GeneLabs 试剂的抗原，间接法,J Virol Methods 1992;38(1):17586.,包被抗原,ORF2,ORF3,1和2型、合成肽和细菌表达,灵敏度和特异性低,ORF2衣壳蛋白，72 kDa,国产抗-HEV试剂盒所用抗原,万泰公司抗原：,IgM，包被mu链，酶标抗原,IgG，包被抗原，酶标二抗,394,606,1,660,特异性高,灵敏度较高,458-607,高达试剂：合成肽？,同时包括了ORF2 和ORF3多肽抗原，

22、具体不详？,首都公共卫生2007;1(4):168-170.,华美公司和科华公司：,灵长动物实验感染后 抗-HEV IgM和IgG应答,Yu, et al. CGLI 2003,急性戊肝病人抗-HEV IgM和IgG应答,Seriwatana, et al. CGLI 2002,如何提高戊型肝炎诊断的准确性？,急性HEV感染，发病时抗-HEV IgM 和 IgG 通常同时阳性,确诊,同时检测抗-HEV IgG和IgM,IgG IgM,IgG IgM,IgG IgM,IgG IgM,12周后 复查,排除,既往感染,IgG IgM,IgG IgM,IgG IgM,确诊,假阳性,假阳性,Ch1374

23、 (Sar-55, I),A450,Ch1375 (Sar-55, 1),458-607,1,660,112-607,0.0,0.5,3.0,3.5,0,2,4,6,8,10,13,15,17,112-607,458-607,475-607,475-607,Ch1374 (Sar-55, 1),感染后周数,感染后周数,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,0,2,4,6,8,10,13,15,17,112-607,458-607,475-607,A450,1.0,1.5,2.0,2.5,利用抗原主要决定簇多肽的高反应性检测阳性标本 利用抗原主要决定簇截短肽的无反应性排

24、除假阳性,如何提高戊型肝炎诊断的准确性？,表达载体,HEV ORF2,1,660,459,459,607,594,ORF2 多肽的蛋白表达,472,607,将重组质粒导入大肠杆菌,1 2 3 1 2 3 1 2 3,459-607 459-594 472-607,kDa,36,22,16,ORF2多肽,大肠杆菌表达ORF2多肽,SDS-PAGE电泳结果,459-607,459-594,472-607,459-607,459-594,472-607,SDS-PAGE加样缓冲液,煮沸 5 min,不加热,ORF2多肽的二聚体特性,SDS-PAGE电泳结果,36,22,二聚体,单体,抗-His6,抗-HEV,抗-HEV,459-607,459-594,472-607,459-607,459-594,472-607,459-607