GB 18133-2000 马铃薯脱毒种薯

GB18133-2000

前言

随着我国经济、国际贸易和技术合作的发展，需要尽快提高我国马铃薯种落的质量，并使之能与国

际标准接轨，有必要制定我国的马铃挤脱毒种薯质量标准。

本标准中附录A,附录B、附录C、附录D和附录E都是标准的附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。

本标准起草单位:黑龙江省农业科学院马铃薯研究所、农业部谷物及制品质t监份检验测试中心

(哈尔滨)、黑龙江省农业科学院生物技术研究中心。

本标准主要起草人:崔荣昌、李芝芳、吴国林、王乐凯、雷勃钧、赫世涛。

中华人民共和国国家标准

马铃薯脱毒种薯

Gs18133一2000

Certifiedseedpotatoes

1范围

本标准规定了马铃薯脱毒苗和各级马铃薯脱毒种薯的质量指标及检验方法。

本标准适用于马铃薯脱毒苗及脱毒种薯生产、销售过程中的质量鉴定。

2定义

本标准使用下列定义。

2.1脱毒苗

应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒

(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)，才

确认是脱毒苗。

2.2脱毒种薯

从繁殖脱毒苗开始，经逐代繁殖增加种薯数量的种薯生产体系生产出来的。

脱毒种薯分为基础种薯和合格种薯两类。基础种薯是指用于生产合格种薯的原原种和原种;合格种

薯是指用于生产商品薯的种薯。

2.2.1基础种薯:分为三级。

22.1.1原原种pre-elite

用脱毒苗在容器内生产的微形薯(Microtuber)和在防虫网、温室条件下生产的符合质量标准的种

薯或小薯(Minituber).

2.2.1.2一级原种eliteI

用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。

2.2.1.3二级原种elite，

一级原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。

2.2.2合格种薯:分为二级。

22.2.1一级种薯certifiedgradeI

用二级原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。

2.2-2.2二级种薯certifiedgradeI

用一级种薯作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。

2.3病毒病株允许率

脱毒种薯繁殖田中病毒病株的允许比率。

2.4细菌病株允许率

脱毒种薯繁殖田中细菌病株的允许比率。

2.5混杂植株允许率

脱毒种薯繁殖田中混杂的其他马铃薯品种植株的比率。

国家质f技术监仔局2000一06一13批准2000一10一01实施

GB18133-2000

2.6有缺陷薯

畸形、次生1龟裂、虫害、冻伤、黑心和机械损伤的薯块。

3控制和汰除的病容

3门控制的病害

3.1.1马铃薯病毒病:脱毒种薯繁殖田中，具有花叶、卷叶、条斑坏死等病毒病症状的植株。

3.1.2马铃薯黑胫病[Erwiniavar.atroseptica(VanHall)Dye.〕或Erwiniavar.carotovora(Jones

Dye.).

3.1.3马铃薯青枯病(PseudomonussolanacearumE.F.Smith),

3.2汰除的病害

3.2.1马铃薯纺锤块茎类病毒(PotaoSpindleTuberViroid.PSTVd),

3.2.2马铃薯环腐病[CorynebacteriumSepedonicum(Sieck&Kott.)Skapt&Burkh],

3.2.3马铃薯癌肿病[Synchytriumendobaiticum(Schilb)Perc.],

4质f要求

4.1各级别脱毒种薯田的植株带病指标应符合表1要求。

表1各级别种薯带病植株的允许率

种若级别

第一次检验

第二次检脸第三次检验

病害及混杂株，肠

病害及混杂株，%

病害及混杂}味，%

类病

毒植

株

环腐

病植

株

病毒

病植

株

黑胫

病和

育枯

病植

株

混杂

植株

类病

毒植

株

环腐

病植

株

病毒

病植

株

黑胫

病和

青枯

病植

株

棍杂

植株

类病

毒植

株

环腐

病植

株

病毒

病植

株

黑胫

病和

青枯

病植

株

混杂

植株

原原种

0000

0000000

0000

一级原种

00

<0.25<0.5

F.25

00

<O.1

<o.25

000

蕊0.1毛0.250

二级原种

00

}GO.25

<0.5

阵。·二

00

<0-1k0.25000

<0-1

阵0.25

0

一级种甚

00

<O.5簇1.0<0.500

}GO·二

<0.5簇0.1

二级种薯

00

成2.0<3.0<1.000<1.0<2.0簇0.1

表2种薯的块茎质量指标

块茎病害和缺陷

允许率，%

环腐病

0

湿腐病和腐烂

<0.1

干腐病

<I.0

疮痴病、黑痣病和晚疫病:

轻徽症状((1%一5%块茎表面有病斑)

中等症状(5写^10%块茎表面有病斑)

簇10.0

<s.0

有缺陷薯(冻伤除外)<O.1

冻伤

(4.0

GB18133-2000

5检验方法

5.1

5.1.1

脱毒苗的检验

脱毒后的检验

某一品种获得一批组培再生苗后，要逐株鉴定带病毒和类病毒状况，检测筛选的无马铃薯X.S,Y

病毒，马铃薯卷叶病毒(PLRV)和类病毒的组培苗才能确认是脱毒苗。检测方法应符合附录A和附录B

的要求。

5.1.2扩繁前的检验

扩大繁殖前，对脱毒苗要再次检测，确认无马铃薯X,S,Y病毒、马铃薯卷叶病毒(PLRV)和类病毒

后，方可用于扩大繁殖。检测方法应符合附录A和附录B的要求。

5.2脱毒种薯的检验

5.2，在种植脱毒种薯的田间进行目测植株质量检验。检测方法应符合附录C的要求。如需进一步确

认时，用附录D中所列的方法检验。

5.2.2检验数量

对田间生长的植株作整体观察后，按表3方法随机抽样检验并记录于表4中。

表3不同面积田块的检验点数和植株数

面积,h.'

检脸点数和每点检脸植株数

<0-1随机抽样检验2点，每点100株

0.11^-1随机抽样检验5点.每点100株

1.1-5随机抽样检验10点，每点100株

)5

随机抽样枪验10点，每点100株，超出5hm'的面积.划出另一检脸区，按本标准

规定的不同面积的检验点，株数执行

表4检验记录

马铃薯脱毒种挤田间检脸记录单

萦种单位:_种落级别:_面积:_品种:_

检验日期:年月日

议

植株

物候

期

每点

株致

混杂

株致

各类病株数

’检验员

(签字)

备注

花叶

病株

卷叶

病株

条斑坏

死病株

黑胫

病株

青枯

炳株

其他

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

总计

缄

5.2.3原原种和原种的检验

334

GB18133-2000

生育期间要进行三次检验。第一次检验是在植株现蓄期，第二次在盛花期，第三次在枯黄期前二周。

由繁种单位检验，做好检验记录并报检验部门备案，需复查时，由检验部门派员复核检验。

5.2.4一级种薯和二级种薯的检验

生育期间进行两次田间检验。检验时间与原原种和原种的第一、二次检验时间相同。

5.3种薯的块茎质量检验

于销售时，随机抽取种薯总量1%的块茎样品进行块茎质量检验。

5.4种薯混杂块茎允许率检验

于销售时，按照块茎的薯形，薯皮颜色，薯肉颜色，芽眼深浅等特征进行种薯混杂块茎允许率检验。

如需进一步确认，按附录E马铃薯水溶性蛋白聚丙烯酞胺凝胶电泳法检验种薯混杂块茎比率。

6判定规则

:‘;

脱毒种薯分级以脱毒种薯繁殖田所播种的种薯级别、带病植株比率和混杂植株比率为定级标准。

各级别脱毒种薯带病毒病株比率，带黑胫病和育枯病株比率以及混杂植株比率三项质量指标，任

何一项不符合原来级别质量标准但又高于下一级别质量标准者，判定结果均按降低一级定级别。

6.3经检验定级合格，签发马铃薯脱毒种薯质量检验合格证书(见表5)0

表5马铃薯脱毒种薯质量检验合格证书

马铃薯脱毒种落质盆检验合格证书

年月日编号

种薯生产单位:

种落级别品种:

重tkg

上述种薯经按中华人民共和国国家标准((GB18133-2000(马铃薯脱毒种璐》)检验合格特发此证.

检验人:(签宇)

检验机关:(印章)

了包装、标签

7.1包装

了.1.，用清洁的麻袋包装。

7.1.2每一麻袋装人脱毒种薯80kg.

7.2马铃薯脱毒种薯标签

7.2.1标签用材要求用较柔软、厚度。.10.0.12mm的白色聚乙烯薄膜制造。应符合图1规格要求。

7.2.2标签正面的项目用黑色5号宋体字印刷，标签反面为空白。在标签正面项目栏中。用黑色记号

笔或蓝色圆珠笔填写记载的事项。

7.2.3麻袋内放人一枚标签，在麻袋外上部拴上一枚标签。

GB18133-2000

背

面

日召.卜

如二0

白口的。人

马铃，脱毒种挤

任。旧。t

级别

品种

已吕11

正面

日U的。1日0价。1

合格证书

编号

白己。人

生产单位

地址

图1马铃薯脱毒种薯包装袋上拴挂的标签

8运输

8.1不同品种、不同级别的种薯在一起运输时严防混杂

8.2防止机械碰伤，防雨、防热、防冻。

GB18133-2000

附录A

(标准的附录)

阵联免痊吸附试验法

(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)

应用双抗体夹心法(DoubleAntibodySandwichMethod)检测马铃薯脱毒苗是否带有马铃薯X,Y,

S病毒和马铃薯卷叶病毒(PLRV)等主要马铃薯病毒。

仪器和设备

聚乙烯微量滴定板:有40孔和96孔两种规格，均可使用。

微量可调进样器:需要2^10pL,10--50pL和10^-200;AL三种规格，并附有相应规格的塑料

魂.，，‘

:0

冰箱。

保温箱:温度定为370C,

玻璃或白瓷制造的小研钵。

酶联免疫检测仪:检测辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase.HRP.)标记的酶标记抗体用

﹃0月q

AIAIAI头AIAIAI

nm波长检测，碱性磷酸(Alkalinephosphatase.AKP)标记的酶标抗体用405nm波长检测。

A2应用的试荆

为分析纯级规格，用水为蒸馏水。

A2.1抗体免疫球蛋白(r-globulin)和酶标记抗体(Conjugate):从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫

球蛋白，将其浓度调为1mg/mL，作为包被微童滴定板的抗体。用辣根过氧化物酶标记的某一病毒的免

疫球蛋白的酶标记抗体，一般使用浓度常在11000以上。贮藏于4℃条件下备用。

A2.2碳酸盐包被缓冲液，pH9.6;1.59g碳酸钠(NaCO,),2.93g碳酸氢钠(NaHCO,)加水到1L,

A2.3PBS-Tween-20缓冲液，pH7.4:8g抓化钠(NaCI),0.2g确酸二氢钾(KH2P04),2.2g磷酸氢

二钠(Na,HPO,·7H,0)(或2.9gNa2HP0,·12H,0),0.2g(抓化钾)KCl，加水到1L，然后加0.5mL

Tween-20。洗涤微量滴定板用。

A2.4样品缓冲液:取PBS-Tween-20缓冲液100mL，加聚乙烯毗咯烷酮(PVP)2g,

A2.5底物缓冲液:取0.2mol/LNa,HPO,·12H20溶液25.7mL加0.1mol/L柠像酸溶液24.3

MI，加水50mL,pH5.0(现用现配)ei}用前加磷苯二胺40mg,30%过氧化氢(H202)0.15mL,混匀，避

光放置。应为白色或微黄色溶液。

A2.6终止液:为。.2mol/L硫酸溶液。用1体积浓硫酸加s份水。

A3操作步级

Al1包被AI滴定板:把免疫球蛋白用包被缓冲液按1，1000稀释，用微A进样器向微a滴定板的

每一样品孔内加人稀释的免疫球蛋白200pL。在37℃条件孵育1h，或在4℃条件下过夜。

A3.2洗涤包被的微量滴定板:甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀释液，再在一业吸水纸上敲打微量

滴定板，以除尽残留的溶液。向微量滴定板的样品孔中加满洗涤级冲液，停留3min，甩掉洗涤缓冲液，

共洗涤3次，以除尽未被吸附的免疫球蛋白。

AM加被检测的样品

Al11取样:在无菌条件下，从试管苗上剪下长2cm茎段，放在小研钵内，把取样的试管苗放回到试

管中，封好管口。把样品编好号，以便按检测结果决定取舍。

GB18133-2000

A3.3.2向小研钵中加样品缓冲液，加人的液量依每个样品上样的孔数而定。例如每个样品准备上样

一个样品孔时，可加人0.4mL样品缓冲液，研磨后可得200uL清液，够上一个样品孔用。

A3.3.3加检测样品:向编好号、洗涤完的微量滴定板的样品孔内，按样品编号、逐个加人提取的样品

液200f}L。每一块微量滴定板上，可设置两个阳性对照孔，两个阴性对照孔和两个空白对照孔。

A3.3.4把加莞样品的微量滴定板，在37℃条件孵育4-6h，或在4℃条件下过夜，然后按A3.2洗涤

微量滴定板。

Al15加酶标记抗体:把酶标记抗体用样品缓冲液按1，100。稀释，向每个样品孔中加人200IL稀

释的酶标记抗体。

A3.3.6洗涤微量滴定板:按A3.2洗涤微量滴定板，以除掉未结合的酶标记抗体。

A3.3.7加底物:向每一样品孔内加底物缓冲液100pL。这是因为使用国产酶标检测仪测定光密度时，

如底物量多，常污染检测镜头，使测得的光密度值不准确;如应用Bio-Rad550型等进口酶标检测仪时

则可加人200pL底物。当观察到阳性对照孔与阴性对照孔显现的颜色可以明确区分时(辣根过氧化物

酶标记的酶标记抗体显现桔红色，碱性磷酸酶标记的抗体显现鲜黄色);或未设对照样品孔的微量滴定

板的一些样品孔之间显现的颜色可以明确区分时，每孔加人30pL终止液，如加人200WL底物缓冲液

时则加人50uL终止液(碱性磷酸酶标记的抗体一般可不加终止液)。

A4结果判定

A4.1目测观察:显现颜色的深浅与病毒相对浓度呈正比。显现白色表明为阴性反应，记录为“一，’i显

现淡桔红色即为阳性反应，记录为“十”;依色泽的逐渐加深记录为“++’，和“十++”。

A4.2用酶联检测仪测定光密度值:样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2倍，即判定为阳

性反应(阴性对照孔的光密度值应簇0.1)0

附录B

(标准的附录)

往复双向斑丙烯酸胶凝胶电泳法

(Two-dimensionalpolyacrylamideGelElectrophoresis)

应用本法检测脱毒苗是否感染有马铃薯纺锤块茎类病毒。

仪器和设备

.1电泳仪。

.2电泳槽。

-3转数为3000r/min以上的离心机。

.4冰箱。

.5高温水浴。

.6微量可调进样器，需要2-10tAL,10-50川,10^-200pL三种规格，并附有相应规格的塑料头。

.7玻璃或白瓷制造的小研钵。

.8带乳头的玻璃小吸管。

.9小塑料盘。

.10牙签、滤纸等。

月.1月..月..月..砚1魂..月..月.1月.es闷.es川eses

BBBBBBBBBBB

B2试荆

为分析纯级规格，用水为蒸馏水

GB18133-2000

B2.1核酸提取缓冲液:0.53mol/L氨水(NH,OH),0.013mol/L乙二胺四乙酸钠〔(Na2-EDTA)，用

三经甲基氨基甲烷(Tris)调为pH7.0],4mol/L抓化锉(LiCD,

B2.2IOX电极缓冲液:0.89mol/LTris,O.89mol/L确酸，2.5mmol/LNa,EDTA,pH8.3,

B2.3载样缓冲液:60mL1X电极缓冲液加40mL丙三醉，含0.25%二甲苯蓝，0.25%澳酚蓝。

B2.4水饱和酚:约为80YOIR的水溶液，内含0.10/u8-R基咬琳。

B2.530%丙始酞胺贮液:丙烯酞胺30g，亚甲基双丙烯酞胺0.75g，用水定容为100mL，过滤，贮于

4℃条件下。

B2.610%过硫酸按溶液:0.1g过硫酸按加水1mL(现用现配)。

B2.7四甲基乙二胺(TEMED),

B2.84mol/L乙酸钠溶液:5.44g无水乙酸钠定容为10mL,

B2.9服:按8mol/L用量加到反向电泳凝胶中，即所谓的变性胶。

B2.10核酸固定液:含10%乙醇,0.5%醋酸的水溶液。

82.110.2%硝酸银溶液.

B2.12核酸显影液:0.375mol/L氢氧化钠(NaOH),2.3mmol/L翻氢化钠(NaBH,),0.4%甲醛

(37%,W/V),

B2.13增色液;70mmol/L碳酸钠(Na,CO,)水溶液。

B3核酸提取

B3.1在无菌条件下，从试管苗上剪下长2cm茎段，放于小研钵中。把取样的试管苗放回试管中，封好

管口，编号，以便根据检测结果决定取舍。

B3.2向小研钵中加人0.4mL核酸提取缓冲液，0.6mL水饱和酚，研碎，倒人小塑料离心管中。

B3.33000r/min(可在3000^8000r/min幅度内离心，一般离心速度高些好)离心15min。用带乳

头小吸管口把上层水相吸到另一清洁的离心管中。

B3.4向小离心管中加入1mL乙醉,1滴4mol/L乙酸钠，混匀后放在冰箱冰盒中至少冷冻30min,

B3.53000r/min离心15min，倒掉乙醉，用少量乙醇轻轻冲洗管壁两次;倒放离心管，控干剩余的乙

醇。

B3.6向每一离心管中加人50pL载样缓冲液，用干净牙签混匀，即可用于上样电泳。

B4

B4.1

电泳

正向电泳:用5写聚丙烯酸胶凝胶，用1X电极缓冲液，进行从负极到正极电泳(上电泳槽的电极

是负极，下电泳槽是正极)，电流量为每厘米宽凝胶5mA。上样量为6pL,

当二甲苯蓝示踪染料迁移到凝胶板中部时(从上样原点迁移约6cm)，折开玻璃板，横切下约1cm

宽的带有二甲苯蓝带的凝胶条，平移到玻璃板的底部边缘，安装好玻瑞板，浴进含8mol/L脉的变性胶;

把玻璃板装回到电泳槽内，变换电极，进行从正极到负极的反向电泳。约20min，当二甲苯蓝带已经完

全进人变性胶中以后，停止电泳。拆开电泳槽，取下玻璃板。

B4.2加温带变性胶的电泳玻璃板，促使类病毒变性。在80℃水浴中，加温电泳玻瑞板30min，然后把

电泳玻璃板装回到电泳槽中。

B4.3反向电泳:是从正极到负极的电泳。电极缓冲液与电流量和正向电泳相同。电泳约2h，当二甲苯

蓝示踪染料带迁移到胶板上方距电泳原点约4cm处，停止电泳，取出凝胶片进行银染色。

B5银染色

B5.1核酸固定:把凝胶片放在盛有200mL核酸固定液的塑料盘中，轻轻振荡10min,然后倒掉固定

液。

GB18133-2000

B5.2向塑料盘中加进200mL0.20a硝酸银溶液，轻轻振荡15min,然后倒出银溶液(可重复使用)。

B5.3用蒸馏水冲洗凝胶板，以除掉残留的银溶液，共冲洗四次，每次用水200mL，每次冲洗15s,

B5.4核酸带显色:加人核酸显影液200mL(现用现配)，轻轻振荡，直到核酸带显现清楚为止，然后用

自来水冲洗停显。

B5.5增色:加人增色液200mLe

B5.6结果判定:在凝胶板下方四分之一处的核酸带为类病毒核酸带(即最下方的核酸带);其上为寄

主核酸带，在寄主核酸带与类病毒核酸带之间有空隙，二者可明显区分开。

附录C

(标准的附录)

马铃，主要病毒病、细菌病和真菌病症状目到鉴别表

按表c1描述的马铃薯植株症状和块茎症状，目测检验马铃薯类病毒，病毒和细菌性病害。

表c1

病害名称植株症状

块茎症状

马铃薯纺锤

块茎类病毒

病株叶片与主茎间角度小，呈锐角，叶片上

竖，上部叶片变小，有时植株矮化

感病块茎变长.呈纺锤形，眼芽增多，芽眉凸

起，有时块茎产生龟裂

马铃薯卷叶病

叶片卷曲，呈匙状或筒状，质地脆，小叶常有

脉间失绿症状，有的品种顶部叶片边缘呈紫

或黄色，有时植株矮化

块茎变小，有的品种块茎切面上产生褐色网

状坏死

马铃薯花叶病

叶片有黄绿相间的斑驳或褪绿，有时叶肉凸

起产生皱缩.有时叶背叶脉产生黑褐色条斑

坏死。生育后期叶片干枯下垂，不脱落

块茎变小

马铃落环腐病

一丛植株的一或一个以上主茎的叶片失水

姜蔫，叶色灰绿并产生脉间失绿症状，不久

叶缘干枯变为褐色，最后黄化枯死，枯叶不

脱落

感病块茎维管束软化，呈淡黄色，挤压时组

织崩溃呈顺粒状，并有乳黄色菌脓排出，表

皮维管束部分与薯肉分离，拼皮有红褐色网

纹

马铃薯黑胫病

病株质小，叶片褪绿，叶缘上卷、质地硬，复

叶与主茎角度开张，茎基部黑揭色，易从土

中拔出

感病块茎脐部黄色，凹陷，扩展到髓部形成

黑色孔润，严重时块茎内部腐烂

马铃落青枯病

病株叶片灰绿色，急剧姜蔫，维管束福色，以

后病部外皮揭色，茎断面乳白色，枯稠菌液

外滋

感病块茎维管束祖色，切开后乳白菌液外

滋，严盆时，维管束邻近组织腐烂，常由块茎

芽眼流出菌脓

马铃薯癌肿病

一般植株生长正常;有时在与土壤接触的茎

基部处长出绿色肉质瘤状物，以后变为揭

色，最后脱落

本病发生于植株的地下部位，但根部不受浸

害。在地下茎、茎上幼芽、甸甸枝和块茎上均

可形成庙肿.典型的庙肿是粗橄柔嫩肉质的

球状体，并可长成一大团细胞增生组织。其

色泽与块茎和甸甸枝相似.如露出地面则带

有绿色，老化时为黑色。块茎上的症状很象

花椰菜

340

Gs18133-2000

附录D

(标准的附录)

马铃，环腐病鉴定法

用格兰氏染色和茄子接种鉴定法结合起来鉴定马铃薯脱毒苗和脱毒种薯是否感染马铃薯环腐病。

当用格兰氏染色鉴定为阳性结果时，再用茄子接种鉴定法进行鉴定，也产生阳性结果时，才能确认是马

铃薯环腐病菌。

D1格兰氏染色(GramStain)

D飞.飞试验设备

D1.1.1显微镜。

D1.1.2载玻片。

D1门，3酒精灯。

D1.2试剂

所用试剂为分析纯级，用水为蒸馏水，个别为无菌水。

D1.2.1龙胆紫染色液:2.5g龙胆紫加水到1L,

D1.2.2碳酸氢钠溶液:12.5g碳酸氢钠(NaHCO,)加水到11。

D1.2.3碘媒染液:2g碘溶解于10mL1mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液中，加水定溶为100mL,

D1.2.4脱色剂:75mL95%乙醇加25mL丙酮。

D1.2.5碱性品红复染液:取100mL碱性品红95%乙醇饱和液，加水到1L,

D1.3取制制备涂片

所有试验用具都要用70%酒精擦拭灭菌。

Dl.3.1鉴定植株:从地表上方2c。处割断，用镊子从切口挤出汁液，滴1滴于载玻片上，风干后，用

酒精灯火焰烘烤2-3次固定。

另一方法是，从切口一端切下0.5cm厚茎片，在小研钵中研磨，吸取1滴汁液滴于载玻片上，风干，

用火焰烤2^-3次固定。

D1.12鉴定块茎:切开块茎，如维管束处有菌脓或渗出物，用镊子压挤，滴1滴于载玻片上，加1滴无

菌水稀释，风干后，用火焰烘烤2^-3次固定。如无渗出物，用镊子从维管束附近取出一些碎组织放在载

玻片上，加一滴无菌水，移掉碎组织。风干后，用火焰烘烤2^-3次固定。

D1.4涂片染色

D1.4.1滴1滴龙胆紫与碳酸氢钠等量混合液(现用现配)于涂片上，染色20s.

D1.4.2滴1滴碘媒染液媒染20s,滴水洗涤。

D1.4.3滴1滴乙醇，丙酮脱色液，脱色5一1os,滴水洗涤。

D1.4.4滴1滴碱性品红溶液复染2-3s,滴水洗涤，风干。

D1.5镜检和结果判定

用10001500倍显微镜镜检，如见到呈蓝紫色的单个细菌或集聚为二、三或四个细菌，即为环腐

病细茵，判定为阳性反应，染成粉红的不是环腐细菌，判定为阴性反应。

D2茄子接种鉴定法

D2.1寄主植物准备

一般常用“黑美丽”(BlackBeauty)品种。先在大花盒中育苗，出苗后移植到装有营养土的花盒内，

每盆1株。当茄子长到2-3周出现第三片真叶时即可用于接种鉴定。

GB18133-2000

D2.2接种体制备

按D1.3.1与Dl.3.2方法制备接种体，加适量无菌水稀释。

D2.3接种方法

用1mL卡介苗注射器吸人制备好的接种体，用4号针头，在茄苗真叶与子叶之间的茎部作针刺接

种，每株茄苗针刺三个部位。接过种的茄苗放在20^-25℃的温室中，保持相对湿度70%以上，每日光照

为12ha

D2.4症状表现及结果判定

接种后1周，第1片真叶叶缘出现水渍状症状，12天后症状发展为叶缘或叶脉间失水萎蔫，褪绿，

22天后发病部位坏死，叶片长成畸形。茄子接种后产生上述症状的，说明接种体中带有马铃薯环腐细

菌，制备接种体的样品为阳性反应;无症状的为阴性反应，证明接种体中不带环腐细菌。

附录E

(标准的附录)

马铃甚块茎水溶性蛋白聚丙烯陈胶凝胶电泳鉴定法

应用马铃薯块茎水溶性蛋白的电泳谱带来鉴定块茎的品种纯度。

El仪器和设备

El.1电泳仪。

E1.2电泳槽。

E1.3转数为3000r/min以上的离心机。

E