实验一 叶绿体色素的分离及理化性质测定

1、实验材料: 菠菜叶片,实验一、叶绿体色素提取分离和理化性质,植物色素： 1）脂溶性色素：叶绿体中叶绿素、类胡萝卜素等 有机溶剂提取，乙醇或丙酮 2）水溶性色素：液泡中花青素、黄酮类物质,实验目的： 1）掌握叶绿素的提取方法 2）了解叶绿素的理化性质,叶绿体中含有绿色素(包括叶绿素a和叶绿素b，酯类化合物)和黄色素【包括胡萝卜素(烃类)叶黄素(衍生的醇类)】两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。,亲水的卟啉环的“头部”: 镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的

2、，可以与蛋白质结合。 亲脂的叶绿醇的“尾巴”: 叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。,叶绿体色素提取原理：,乙醇提取叶绿体色素： 1)取菠菜叶片洗净、擦干、剪碎、混匀，称2g左右，放入研钵中。 2)加入少量石英砂及碳酸钙粉，加12滴管95%乙醇，研磨至糊状; 再加1015ml 95%乙醇，提取13min，过滤于三角瓶中(滤纸用乙醇润湿） 3)残渣用5ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。,水提取叶绿体色素：,取2g剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂(不加碳酸钙粉)，用水研磨。先加2ml蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水20ml，搅匀，不过滤。,注意：色素乙

3、醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能做光破坏实验，否则在短时间之内效果不明显。,1.光对叶绿素的破坏作用,因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相(流动相和固定相)间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。,2.提取液中各成分分离：,色层分析的原理：,吸附剂：滤纸 推动剂：石油醚:丙酮:苯(10:2:1),叶绿体色素的结构决定极性不同，因而在滤纸上的迁移速率不同。,1)圆形定性滤纸1张,用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔; 2)取一张窄滤纸条,沿纸条长度方向涂色素，限制在0.5cm，垂直风干，重复涂抹10次。 涂抹色素要

4、适量，量多拖尾，量少色带看不清。 技巧方法：将浓色素滴到玻璃皿盖上，涂抹纸片 3)沿长度方向卷成纸捻; 4)纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中， 色素一端与滤纸平齐(勿凸出)。,2.提取液中各成分分离：,4)康维皿放置培养皿内，中央室中加4/5以上的推动剂。 5)把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入 推动剂中。盖好培养皿(为什么)。 6)推动剂到达滤纸边缘1/2时，取出滤纸，风干。 7)剪下一部分滤纸，附到实验报告中。,注意事项： 1、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。 细，匀，直，浓。 2、涂抹的色素要适量，量多易拖尾，量少色带弱 3、纸捻卷紧； 4、色素涂抹的宽度不要超

5、过纸条的二分之一； 5、中心孔小又圆；平齐，勿突出； 6、分离时一定要盖严培养皿盖，防止推动剂蒸发。 7、实验结束后，推动剂倒入到专用回收桶中。,从外往内分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色。,实验结果：,胡萝卜素分子最小，单纯的碳氢化合物，溶解度最大，扩散速度最快； 叶黄素中有两个-OH、极性增加，其分子量稍大于胡萝卜素，低于叶绿素，所以扩散速度仅次于胡萝卜素； 叶绿素a、叶绿素b都有一个亲水的“头部”，扩散速度慢； 叶绿素a扩散速度快于叶绿素b(醛基)，叶绿素b扩散的最慢 。,可渗透物质相似相溶原理 色素分子的结构和极性共同决定了迁移率的大小,取一支20ml的刻度试管，加入5ml浓的叶绿素乙

6、醇提取液，观察透射光和反射光的颜色。,植物叶片是否发射荧光？为什么，如何进行检测？,*观察完后保存好试管内提取液，准备皂化反应,叶绿素酒精溶液的荧光强度较强，约达其吸收光的10左右，而鲜叶的荧光强度较低，只占其吸收光的0.l1。,透射光下为翠绿色 反射光下为棕红色,3、叶绿素荧光现象,620720nm,4、皂化作用（绿色素与黄色素的分离）,C32H30ONMg,COOCH3,COOC20H39,+ 2KOH,C32H30ON4Mg,COOK,COOK,+ CH3OH + C20H39OH,叶绿醇,甲醇,叶绿素是一种二羧酸-叶绿酸和甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，可与碱起皂化反应，生成醇和叶绿酸的盐，

7、产生的盐能溶于水，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。,操作步骤： 1、叶绿素荧光观察所有试管中，加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀； 2、加入5ml苯，摇匀 ； 3、沿管壁加入适量蒸馏水1-1.5ml，只需轻微摇动。,注意：如果分层后下部的溶液浑浊，可以剧烈摇动，对试管水域加温，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。,黄色素,绿色素,5、吸收光谱的观察,在光谱中的红光与蓝紫光的部位就会出现很深的黑带，表明这些光线已被叶绿素强烈吸收；而绿光部位没有黑带，也就是未被吸收。,胡萝卜素与叶黄素主要吸收蓝紫光，基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。,如果在阳光与三棱镜之间插入一支盛有叶绿体色素的试管：,因此，叶绿素呈现绿色。,叶绿素中的Mg2+被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素 铜取代H+形成绿色铜代叶绿素，相对稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本,6、H+和Cu+对叶绿素分子中Mg+的取代作用,1.填写记载表