免疫组化技术.ppt

1、免疫组织化学技术、免疫组织化、免疫组织化、免疫学的基本原理抗原抗体反应抗原和抗体特异性的结合原理，通过化学反应标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)，决定组织细胞内抗原(多肽、蛋白质)，以及前者使用标记辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉、激素等)。在光学显微镜或荧光显微镜下，可以清楚地看到细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而在组织切片中确定特定化学成分的分布和含量。实验中使用的标本主要使用组织标本和细胞标本，包括石蜡切片(病理切片和组织芯片)和冷冻切片、组织印花、细胞攀登板、细胞涂层。其中石蜡切片是制作组织标本最常见、最基本的方法，能保存好组织形态，连续

2、切片，有利于各种染色对照观察。为了回顾性研究，可以长期保存。实验中使用的抗体，免疫组织化实验中常用的抗体是单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体用B淋巴细胞克隆分泌抗体应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化的抗原直接免疫动物后从动物血液中获得的免疫血清，是多B淋巴细胞克隆引起的抗体混合物。组织或细胞中可以用作蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸、致病源等抗原或抗原的任何组织，都可以用相应的特异性抗体检测出来。免疫组织化的特点，特异性强敏感性高位置准确度，形态和功能相结合，免疫组织化程序，1 .石蜡切片制作，1，固定：组织，用PBS冲洗，在4%聚甲醛磷酸盐缓冲液中1

3、2h 2，脱水：去除固定液95%酒精3h，无水酒精()，()分别为2h 3，透明：1:1无水酒精二甲苯；100%的绝对乙醇：25分钟；95% ethanol 2 minutes；乙醇95%，2分80%，乙醇2 minius；70% ethanol 2 minutes；Distilled water :5min；蒸馏水：5分钟PBS 3次3分钟。2，细胞透明，封闭的内源性过氧化物酶用封闭的透明液浸泡切片30 min(RT被光)。配方是预热40毫升PBS，加热120ul TritonX-100(也称为特拉通X-100，洗涤剂)几分钟，然后在任用前添加400 ul 30H2O2。PBS溶液冲洗3次3

4、分钟。3、将抗原修复暴露抗原决定基切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)后，在微波炉中煮4分钟左右，再加热约6 min4次，每间隔填充液体防止干燥，4、将非特异性蛋白质PBS溶液清洗3次3分钟左右。去除切片，将周围的水分吸入滤纸，用组织笔在组织周围画圈，在圆圈内滴下5%的羊血清(与2抗原一致)，然后放入湿盒子，室温30 (1030) min。5，孵化一次，撒上切片的量血清，用滤纸擦拭组织周围的残留血清，直接添加稀释的一项(1: 250，500，1000)，将室温放在湿箱子里1小时左右，然后过夜，从冰箱中取出37伏温45毫升。6，2段孵化被一段击倒，用PBS冲洗5 min5次。用滤纸

5、吸干圆圈周围的水，加入稀释后的二项式剂，放入37恒温烤箱中30 min(回收)。用PBS洗5次5分钟；7，SP反应进入SP后，放入37度烤箱30分钟。用PBS洗5次5分钟；8、颜色附加DAB(快速滴、染色情况观察、染色液去除)，颜色时间调节约5 min(310 min)，镜面观察颜色控制时间。0.05DAB(避光)(1:20备件):5 ul 20DAB0.1 ul 30% H2O295 ul PBS。1储备的赵霁：50mg DAB 5ml 0.05 mol/L PBS完全溶解，-20保留。9，再染色，脱水，透明，封用PBS 3次3min后双蒸气5min；洗投篮。放入一滴牛染色液，细胞核蛋白染色

6、几秒钟，细胞质或细胞膜蛋白染色20 s，然后冲洗自来水，用双蒸洗5 min，然后将蓝色5 min返回PBS。脱水50%乙醇1-2 min，70%乙醇1-2 min 95%乙醇1-2min；95% ethanol 1-2分钟：100% absolute ethanol 3360(1-2)min:100% absolute ethanol :(1-2)分钟透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min盖：中性口香糖。结果分析：每个切片选择5个高比例视野(400X)，应用图像分析系统进行定量灰度图像扫描后分析。设备、温度调节器(水浴盆)、冰箱、切片机、幻灯片和封面幻灯片、

7、压力锅或微波炉、染缸、显微镜、显微镜1000ml 0.2 MPB(ph 7.4)5.93g nah 2 po 42 H2O 58.02g Na2 hpoCitrate Buffered Saline(0.01 M柠檬酸缓冲，ph 6.0):28ml a72 ml b200 ml ddh 2o(a . Citrate acid(柠檬酸):将10.5 g双汽船增加到1000ml B，固定液：4%聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4) a.0.1M磷酸盐缓冲液：将A液400毫升和B液80毫升混合后，将pH调整为7.4。500ml A液体：0.1mol/L na 2 hpo 4(na 2 hpo 412 H

8、2O 35.8g水郑容和1000ml) B液体：0.1mol/L nah 2 po 4(nah 2 po 42 H2 o 15.6g将水放入1000ml)嵌入剂：石蜡脱脱剂：聚赖氨酸(PLL5g蒸馏水1000毫升)，APES(3-氨丙基-3-乙氧基甲基硅烷)细胞透明液：在最终浓度中分别为0.3%过氧化氢，0.3% tritoo，5羊血清或封闭血清，稀释为PBS。包含0.03H2O2的0.05DAB重氨基苯甲丁(回避):20DAB (1，10MG/ML) 5UL 0.1UL 30% H2O 295UL PBS。一项(特异性结合气质)，二项均稀释为PBS。二甲苯、梯度醇(1002，95，80，70

9、，50)、双蒸气水、中性橡胶液(标记剂)。发色剂：DAB试剂盒，牛木牛染液，注意事项，牛木牛复盐时间需要摸索，尤其是阳性染色也在细胞核内。DAB发色时间应达到优化，镜下观察阳性染色明显，但背景不太深。应探讨抗体孵化时间和抗体浓度。特别是一航孵化最好在4点过夜。切片脱蜡和手语应该足够了。添加反应液时，要充分复盖组织。每次添加液体前喷洗液，但阻止干燥剂。用组画画圈的时候，尽量画得大一些。否则，墨水会把液体挤出来，引起周围的干片。薄膜着色不均匀的原因如下：脱蜡不足。60烤20分钟马上新鲜xylene1可以放。手语不完整。新鲜梯度乙醇要经常准备。抗体没有很好地混合。使用吸管完全混合一元/二元和其他试剂。抗体孵化后，切片倾斜。抗体孵化后PBS清洗不足。制作厚度不均匀等问题。染色箱不均匀，切片倾斜了。为什么在第一段从4中取出后，说37度要复温？另一方面，将切片直接从4放入PBS中，防止其轻易剥落。另一方面，进一步稳定抗原抗体结合。一般不需要，但对表达弱抗原很有用。4度和37度的分子运动方式不同。前者分子碰撞概率和运动速度比后者低，后者结合得更快，但敏感性也提高，容易引起非特异性染色。切片染色后背景太深，很难区分特异性和非特异性着色吗？抗体孵化时间太长，抗体浓度高，背景着色容易增加。这可以缩短1/2段孵化时间，稀释抗体进行调节。一抗多克隆抗体容易发生非特异性着色，建议使用单克隆抗