第五章其他分离方法.ppt

1、06:24:13,第5章 其它色谱方法,06:24:13,纸层析和柱层析法薄层色谱,高效毛细管电泳,超临界流体色谱,06:24:13,纸层析,06:24:13,一、纸层析分离过程,纸层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。,纸层析流动相的移动是依靠毛细作用。 将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。 Rf 值相差越大，分离效果越好,06:24:13,二、操作技术,1.层析纸和层析板 特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂

2、（硅胶或氧化铝，200250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。,06:24:13,2.展开剂,由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。,06:24:13,3. 点样,用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。,06:24:13,4.显色、检测,有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。,06:24:13,三、特点及应用,平板色谱简单、方便、及操作费

3、用低， 可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。 采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。 试样一般不需要经过预处理即可分离。,06:24:13,缺点： 分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。 应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。,06:24:13,柱层析,06:24:13,柱层析：是吸附色谱的一种，它利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的

4、组分逐一洗脱分离的一种分离方法。 微型柱层析实验,06:24:13,实例:,凝胶过滤层析纯化细胞色素C,06:24:13,一、目的要求,1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯化,06:24:13,二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,06:24:13,06:24:13,优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bi

5、o-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶,06:24:13,凝胶及柱的选择,06:24:13,凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡 装柱时要注意操作压。,06:24:13,装柱的两种方法： a.手工操作 1/3床体积水加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床打开出水口连续缓慢加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法,06:24:13,样品上柱 分析用量：柱床体积的12% 制备用量：柱床体积的2030% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰,06:24:1

6、3,三、试剂与器材 试剂：0.01mol/l Tris-HCl缓冲液，PH7.5，含0.2mol/l NaCl 器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪 、记录仪,06:24:13,（二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。 （三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上

7、放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。,06:24:13,（四）加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液1 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入34 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。 （五）洗脱 洗脱

8、时，打开上、下进出口夹子，用0.025 mol/LTris-HCl，以每管3 mL/10 min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。,06:24:13,06:24:13,六、注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。,06:24:13,薄层层析法（TLC）,06:24:13,引言,历史： 薄层层析法TLC：50 年代后在纸层析和柱层析的基础上发

9、展起来 1951年J.G.kirchner首先对其进行了系统的研究 1958年E.Stahl对薄层层析用的吸附剂和涂层工具进行改进并使之标准化，克服了技术上的困难，使TLC获得迅速发展 定义： TLC是把固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层，把试液点在层析板（即薄层）的一端试样中各组分就被吸附剂所吸附，由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着吸附薄层上升，试样溶解在展开剂中，在固定相和流动相之间不断的发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。 优点： 快速，做一次薄层层析只需10-60min； 分离效率高；灵敏度可达0.01g； 层析后可用各种方法显色，甚至可喷强腐蚀性的浓硫酸，可高温灼热； 应用面

10、广，可以进行定性及定量测定 对于各种试剂，可选用不同的吸附剂和展开剂 可做吸附层析、分配层析以及离子交换层析。 薄层层析法,06:24:13,原理,展开剂在薄层中的流速与展开剂的表面张力、粘度及吸附剂的种类、粒度、均匀度等等因素有关，即和层析系统（固定相和流动相）有关，也和展开距离有关。 塔板理论亦可应用于TLC中，将塔板高度和展开距离联系起来。 TLC中层析效率同样可用分离度表示。 Rs=2(x2-x1)/(w1+w2)。 当Rf=0.33时，Rs值最大，分离最好。 选择合适的吸附剂和展开剂是TLC分离能否获得成功的关键。,06:24:13,原理,吸附剂 ：最常用的是氧化铝和硅胶。 展开剂

11、：可用单一的溶剂并且还常常把各种溶剂按不同比例混合配 成混合溶剂以作展开剂。 铺层：干法铺层-简单快速、随铺随用，但不能保存，易被吹散。分 离效果差。层析展开较快。 湿法铺层-常用有倾倒法、刮层法、涂铺器铺层法。 点样：需用易于挥发、极性和展开剂相似的溶剂溶解试样以得到 0.5-1%的试液。可用毛细管或微量注射器把试样点成小圆 点或长条。力求快速 展开：上行法-常用 干板近水平方向展开 硬板采用近垂直方向展开 下行法-比上行法快，但分离效果较差。,06:24:13,SW-86,过去的TLC,06:24:13,现代平面色谱,06:24:13,应用1 传统中药中糖的分析,糖广泛存在于中草药中，干重

12、占整个植物的80-90% 中药中多糖的分析在制药上有非常重要的意义 TLC可以用来纯化测量和从寡糖、多糖中确认单糖,06:24:13,应用2低分子量化合物快速成像,TLC-MALDI-TOFMS对微量分析展开以及原位操作有高速度和选择性。对于低分子量分析物，基质的背景离子常引起严重的干扰。 使用UV吸收质子给体离子液体（Et3N-CHCA）作为基质分析低分子量物质如生物碱Arborescidine A、B、C，麻醉剂Levobupivacaine、Mepivacaine和抗体Tetracycline。,06:24:13,应用3 TLC-MALDI-TOFMS分析粗型脂多糖LPSs）和Lipid

13、 A,内毒素LPSs的混合物，其脂结构域 称为Lipid A，与多种生物活动相 关，没有O链的LPSs称为粗型LPS 使用TLC，选用合适的溶剂在硅胶 上选择性的萃取分离完整细胞的LPS 组分，所得分子物种的谱带在无损伤 成像后从板上刮下来直接和基质混 合，用 MALDI-TOFMS进行分析 基质加入柠檬酸极大改善谱图 TLC直接从细胞中萃取分离出LPSs 并进行表征，快速、灵敏，可用于结 构和血清分析。,06:24:13,应用4 TLC-VC-MALDI MS分析神经节苷脂,神经节苷脂广泛存在于动物细胞外膜表面，代谢、生物合成、生理性质均引起人们注意。其中TLC是分析这类糖脂混合物以及其生物

14、行为的标准工具17-18。TLC和MS偶联起来可以满足结构分析 使用1-10mbar达到振动冷却（vibrational cooling）即用TLC-VC-MALDI-FTMS分析神经节苷脂,Vera B. Ivleva etc. Anal. Chem.2004, 76, 6484.,TLC-VC-MALDI-FTMS联用样品处理简单，可以二维成像 傅里叶变换有高分辨率和准确度，可以更好的分析结构细节 外置离子源可规避TLC板的不规则表面引起的分辨率和准确度的降低 TLC板还可直接与MALDI相连，不需对分析物进行再次萃取。,06:24:13,5 TLC板荧光成像分析神经节苷脂,Tomohir

15、o Hayakawa等人利用100C以下仅有唾液酸发荧光的特征，通过荧光成像定量测定神经节苷脂 神经节苷脂上唾液酸浓度与荧光强度的线性范围47pM-4.5nM TLC板上的荧光成像分析可以测量更宽范围的神经节苷脂 通过调整加热温度，可分析糖脂类物质。该方法简单、低廉、重现性好、不需特殊试剂、不需荧光标记，可以定量测定。,Tomohiro Hayakawa; Mitsuhiro Hirai Anal. Chem.2003, 75, 6728.,06:24:13,进展,解析电喷雾电离（DESI）是新的大气压解析电离方法 DESI主要应用于表面分析，TLC可以通过DESI和MS偶联,06:24:13

16、,总之,TLC省时、省原料，可以同时分析多种样品。耗资少，所需仪器少，所需操作培训少，它是一种平面的分离手段，极易和MALDI-MS(基体辅助激光解吸电离质谱法 )联用，甚至可以在原位分析多种物质，也有许多尝试应用不同的电离源来进行结构和定量测定，在许多领域都有潜在的应用前景。,06:24:13,高效毛细管电泳,一、高效毛细管电泳基本原理 二、仪器装置 三、影响柱效的因素及改进方法 四、主要特点和应用,06:24:13,高效毛细管电泳仪器（1）,06:24:13,高效毛细管电泳仪器（2）,06:24:13,高效毛细管电泳仪器（3）,06:24:13,一、高效毛细管电泳基本原理,在电解质溶液中，

17、位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。,1.经典电泳分离法的不足 所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。,06:24:13,2.高效毛细管电泳技术上的重要突破,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管,； 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱

18、长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,06:24:13,3.电泳现象与电渗流现象,电泳现象： 带电离子在电场作用下的迁移，速度电泳,电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基, pH3时, 形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,06:24:13,4. 分离过程,电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流 电泳时,阴

19、离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,06:24:13,5.分离类型,八种分离类型 (1) 毛细管区带电泳（CZE） 最普遍、最基本的一种分离模式。,(2) 毛细管凝胶电泳（CGE） 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。,06:24:13,(3) 毛细管胶束电动色谱（MECC）,在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于

20、电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳 ，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。,06:24:13,二、仪器装置,电压：030KV。 分离柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光诱导荧光检测器 （可检测到：10-1910-21 mol/L）,06:24:13,三、影响柱效的因素及改进方法,热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。,电

21、渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。,使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。,06:24:13,四、主要特点和应用,高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。 高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。 高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质. 试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样 仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。,不足之处： 进样不够方便。应用范围相对较窄。 分析

22、阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。,06:24:13,超临界流体色谱,一、超临界流体色谱的特点与原理 feature and principle of SFC 二、超临界流体色谱仪的结构流程 structure and general process of SFC 三、超临界流体色谱的应用 application of SFC,supercritical fluid chromatograph, SFC,06:24:13,Berger(产地：美国)超临界流体色谱仪(SFC),06:24:13,JASCO(产地： 日本)超临界色谱仪(S

23、FC),06:24:13,一、超临界流体色谱的特点与原理principle and character of supercritical fluid chromatography,1.概述 超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。 超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:,（1）可处理高沸点、不挥发试样； （2）比LC有更高的柱效和分离效率。,06:24:13,2. 超临界流体性质,（1）性质介于液体和气体之间; 具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。 （2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。 超临界流体的密度与压力有关。,06:24:13,3.原理,SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC； 分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；,06:24:13,压力效应：,SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影