第四章 发酵工业的无菌技术.ppt

1、第四章 发酵工业的无菌技术,第一节 发酵工业污染的防治 第二节 发酵培养基及设备管道灭菌 第三节 空气除菌,纯种培养要求必须防止杂菌污染 为防止染菌，采取了一系列措施： 密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作； 染菌无法彻底避免；据报道： 国外抗生素发酵染菌率为25%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为2，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为12。 染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。,第一节 发酵工业污染的防治,一、污染的危害,1、染菌的不良后果 消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大,2.

2、染菌危害的具体分析,（1）染菌对不同菌种发酵的影响 A细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。,B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 。 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。,（2）染菌种类对发酵的影响,青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染

3、青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染,（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响,种子扩大时期染菌:灭菌后弃去。 发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种。 发酵中期染菌：危害极大、挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。 抗生素发酵 ：输入正常发酵已产抗生素的发酵液。 柠檬酸发酵： a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌 。,b. 污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。 c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：

4、在pH很低下能够生长。提前放罐。 发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵。 污染严重，则提前放罐。 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价。,（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响,丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难。 处理方法： 将发酵液加热后再加助滤剂； 先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化。,二、杂菌污染的防治,1、染菌的检查与类型判断 (1)显微镜检查法：菌体 (2)平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采

5、用双层平板法：噬菌斑 (3)肉汤培养检查法 （酚红变色pH6.8-8.4） 以上方法缺点： 镜检出杂菌需要一定时间。,(4)发酵过程的异常现象判断 DO2水平异常变化： pH异常变化： 污染产酸菌或者利用碳源效率高生长较快的杂菌 尾气CO2异常变化： 染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌体，糖耗减慢， CO2含量减少。,1,2,污染噬菌体后异常现象,2. 污染原因分析,主要原因： 种子带菌 无菌空气带菌 设备渗漏 灭菌不彻底 操作失误 技术管理不善,(1)从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与灭菌不彻底有关。 球菌、无芽孢杆菌：与种子带菌、 无菌空气带菌、 设备渗漏

6、、操作失误有关。 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与操作失误、 技术管理不善有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题。 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长。,(2)从污染时间看： 早期污染可能与种子带菌、无菌空气带菌、灭菌不彻底 、操作失误 有关。 后期污染可能与设备渗漏、操作失误及中间补料有关。 (3)从染菌幅度看： 各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题。 个别罐连续染菌，一般是设备问题。,3、杂菌污染的途径及其预防,(1)种子带菌的防治 灭菌彻底：培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压。 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠。 保藏可靠： (

7、2)过滤空气带菌的防治 提高空气进口的洁净度。 除尽压缩空气中的油和水。 保证空气过滤器介质的填装质量。,(3)设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治,发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件。 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口。 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”,发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”,法兰连接不当造成的“死角”,灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法,设备渗漏引起的染菌及其防止 发酵设备、管道

8、、阀门长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗漏。 方法：选用优质的材料，并定期进行检查。 微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞 指示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。,(4)培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 假压：实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂，防止泡沫升顶。 连消不彻底 ：蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，最好采用自动控制装置 。 灭菌后期罐压骤变：灭菌后，冷却水冷却时，如冷却过快造成罐内负压造成染菌。冷却前先通入无菌空气维持罐内一定的正压，再进行冷却 。 死角 ：消除。,(5)操作不当造成染菌 移种时或发酵

9、过程中，罐内压力跌至零。 管道阀门操作不当，无菌空气的压力突然下降，罐内压力高，发酵液倒流进入与发酵罐液面下相连的各个管道以及空气过滤器 。 (6)噬菌体染菌及其防治 以净化环境为中心的综合防治法。,采取哪些措施能够保持无菌发酵？,物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； 好气发酵通入的空气要除菌； 种子无污染；接种无菌操作过关； 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。,培养基灭菌的定义 是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其芽孢或孢子，或从中将其除去。 工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。 灭菌与消毒

10、的区别 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿表面的微生物。,第二节 发酵培养基及设备管道灭菌,1.化学试剂灭菌法,甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒,2.射线灭菌法,3.干热灭菌法,电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱,常用烘箱，灭菌条件：160下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿,4.湿热灭菌法,利用饱和蒸汽灭菌，条件：121，30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌,5.过滤除菌法,利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气,6.火焰灭菌法,火焰

11、 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口,一、常用的灭菌方法,湿热灭菌的优点： 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； 蒸汽有很大的潜热（冷凝热）； 操作方便，易管理。,培养基的湿热灭菌,热阻,定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死亡速率常数k来表示 。 k，热阻, t,当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。 当 T 变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律 k=Aexp(- E/RT) k与微生物活化能及T有关,热阻,大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线,影响培养基灭菌的其它因

12、素,培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。,pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。 培养基的物理状态：固体时间大于液体 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量：数量多，时间长。,影响培养基灭菌的其它因素,将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌

13、的过程，也称实罐灭菌。,二、分批灭菌,分空气过滤器灭菌 并用空气吹干,夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽,达70左右,取样管,放料管,通蒸汽,120，1105pa,保温,保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定,罐压接近空气压力,向罐内通无菌空气,保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门,夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度,1.灭菌工艺过程,240,160,120,80,时间（min),0,50,100,150,温度,升温,冷却,保温,培养基分批灭菌过程中的温度变化情况,2、过程包括： 升温、保温和冷却三阶段。

14、各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%。,三、连续灭菌（又称连消）,将配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的 同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作过程。 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程,发酵罐,蒸汽,原料,冷却水,无菌培养基,配料罐,泵,加热塔 （连消塔）,维持罐,冷却管,1、灭菌工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程,连续灭菌的流程与设备,1、配料预热罐：将配制好的料液预热到7090 ，以免连续灭菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击及时间长导致冷凝水过多； 2、连消塔：用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（110130，20 30S）； 3、维持罐：使料

15、液在灭菌温度下保持825min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的； 4、冷却罐：使料液冷却到40 50C后（冷水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。,喷淋冷却器,结构简单；广泛使用,板式换热器,体积小，换热效率高；但流动阻力较大,板式换热器,板式换热器,板式换热器原理图,2、分批灭菌与连续灭菌的比较,连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。,缺点：

16、对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。,分批灭菌与连续灭菌的比较,分批灭菌与连续灭菌的比较,1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌: 从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147MPa，维持45min，灭菌过程中，从所有液位以上的阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过这些阀门以防止出现死角。灭菌完毕后，关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压0.098MPa。,四、发酵培养基及设备管道灭菌技术,2、空气总过滤器和分过滤器灭菌： 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，

17、并从上、下排气口排汽，维持压力0.147MPa灭菌2 h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。 3、种子培养基实罐灭菌 ： 从夹层通入蒸汽间接加热至80，再从取样管、进风管、接种管等液面以下的阀门通入蒸汽，进行直接加热。同时关闭夹层蒸汽进口阀门、升温至121，维持30 min。期间，所有液面以上的阀门保持一定时间的排汽状态。,4、发酵培养基实罐灭菌： 从夹层或盘管式热交换器进入蒸汽，间接加热至90，关闭夹层及盘管蒸汽，从取样管、进风管、放料管等液面以下的阀门通入蒸汽，直接加热至121，维持30min。期间，所有液面以上的阀门保持一定时间的排汽状态。 5、发酵培养基连续灭菌： 一般培养基连续灭菌采用灭菌

18、温度为130，维持5min。 6、补料实罐灭菌; 根据料液不同而异，淀粉料液为121，维持510min。尿素溶液灭菌为105，维持5min。,一、空气除菌方法 二、空气过滤除菌流程和设备 三、几种典型的空气净化流程,第三节 空气除菌,（一） 辐射灭菌 （二） 加热灭菌 （三） 静电除菌 （四） 过滤除菌,一、空气除菌的方法,（一）辐射灭菌 1，原理 射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。 2，应用范围 通常用于无菌室和医院手术室。 3，缺点 杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度,（二）加热灭菌

19、利用压缩热进行空气灭菌的流程图 空气压缩后温度能达到200度左右，保持一定时间后，便可实行干热杀菌。 图中空气进口温度为21C，出口温度为187198C，压力为07MPa。,（三）静电除菌 1，原理 利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。 2，优点 阻力小，约1.01325104Pa 染菌率低，平均低于10-15 除水、除油的效果好 耗电少 3，缺点 设备庞大 、一次性投资较大 、捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。,（四）介质过滤除菌 1，原理 介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。 2，优点 从可靠性，经济适用与便

20、于控制等方面考虑，目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂广泛采用的方法。,两级冷却、分离、加热的空气过滤除菌流程： 流程的特点是：两次冷却，两次分离，适当加热。,二、空气过滤除菌流程和设备,（一）空气预处理,1. 预处理目的： 除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤器寿命；措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器 降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水滴） 加热：保持相对湿度 稳压：防止压力波动，贮罐,2、预处理设备 (1)采风塔 采风塔应建在工厂上风处，远离烟囱。远离地

21、面几十米，至少10米。 一般而言，地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。,(2)粗过滤器 作用：是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同时也可减轻总过滤器负荷。 要求：过滤效率要高，阻力要小；否则会增加压缩空气的吸入负荷和降隐低压缩空气机的排气量。 常用的粗过滤器有： 布袋过滤 填料过滤 油浴洗涤 水雾除尘 (3)空气压缩机：产生压缩空气 往复式，涡轮式，螺杆式等,(4)空气贮罐 作用：是消除压缩机排出空气量的脉动，维持稳定的空气压力，同时也可以利用重力沉降作用分离部分油雾。 贮罐的

22、大小可按下面的经验公式计算：,(5)空气冷却器 空气压缩机出口温度高，必须冷却。冷却还可除湿。 常用的空气冷却器有： 立式列管式热交换器 沉浸式热交换器 喷淋式热交换器 (6)气液分离器 冷却后的压缩空气含油滴和水滴需分离出去来保护过滤介质。 常用的气液分离器有： 旋风式：旋风分离器 填料式：丝网除沫器,旋风分离器,丝网除沫器内部同时采用直接拦截，惯性碰撞，布朗扩散及凝聚等机理，能有效地去除空气中的水、油雾、尘埃，内部不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。,(7)空气加热器 压缩空气经气液分离器后相对湿度为100，必须加热使之降至70以下。 常用的空气加热器有： 立式列管式热交换器 沉浸式热交换器 喷

23、淋式热交换器,(二)空气的过滤除菌 空气过滤除菌介质 棉花：纤维细长，16-20um，填充150-200kg/立方米 玻璃纤维：直径8-19um，直径越小越好，但小易断，缺点：更换时碎末飞扬，过敏 活性炭 ：大表面，物理吸附，空气阻力小，常夹带在二 层棉花中降低阻力，为整个过滤器的1/3-1/2 超细玻璃纤维纸：以拦截为主，直径1-1.5um，有较高过滤效率。缺点为强度差，受温后纤维松散。只用于分过滤器。可加入木浆纤维或其他纤维或采用树脂并加疏松剂。 石棉滤板：蓝石棉20加80纸将混合打浆。温强度大，过滤效率低，耐蒸气反复杀菌。 烧结材料过滤介质：金属烧结管过滤器。 新型过滤介质 ：微孔滤膜,

24、、棉花活性炭过滤器 棉花是最常用的过滤介质，通常要用纤维不太长的原棉，因为它具有一定的弹性，虽然几经湿热灭菌，干燥后仍能保持原有的疏松状态。棉花的过滤阻力较活性炭大（1012倍）。 活性炭通常被加工成粒状，其过滤效率比棉花低，但具有阻力小，吸附力强（可吸附空气中有害物质，如油、水）的特点，通常与棉花介质一起使用，减少过滤层的阻力。,棉花活性炭过滤器的过滤效率可达99%. 其过滤介质装填为： 上部和下部装填棉花，其厚度为总过滤层的2（1/41/3），中间再装入1/21/3厚度的活性炭。一般棉花的填充密度为150200公斤/米3，活性炭40450公斤/米3。 孔板 金属丝网 麻布织品棉花麻布织品活

25、性炭麻布织品棉花麻布织品金属丝网孔板,2、滤纸过滤器 以超细玻璃纤维纸为过滤介质。,3、金属烧结管过滤器 过滤系统由 金属过滤器、预过滤器及蒸汽过滤器组成。预过滤器的作用是将空气前处理系统中的铁锈等杂物进行预滤。 蒸汽过滤器则是阻挡蒸气管路中的锈蚀物和锅炉污垢等杂质。上述二种过滤器的功能是保护金属过滤器，延长其使用寿命。 过滤介质：预过滤器为中空玻璃纤维或高效过滤纸，蒸汽过滤器为聚四氟乙烯,金属过滤器为金属粉末镍冶炼而成。,金属过滤器,外壳图,外壳滤芯接口图,4、微孔膜过滤器 过滤介质：微过滤膜，孔径：0.10.01m 过滤系统由蒸汽过滤器、预过滤器（粗）、除菌过滤器（精）组成。 （1）预过滤

26、器 形式：以管式、袋式、折叠式为主，也可以是填充床式、浮动床式的过滤器，以及离心机、真空机等过滤器材。 预过滤器一般选用深层过滤器，在使用过程中要求有低的压降、高的容尘量和变动幅度小的过滤精度和效率。 过滤介质：玻璃纤维复合毡（聚丙烯纤维复合毡）。,除菌过滤器 形式以板框式、管式、折叠式为主 过滤介质：微过滤膜（聚偏氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚砜膜、聚酰胺膜等。） 除菌过滤应具备的特点： 高的过滤精度; 大的通过量; 能耐反复的消毒操作; 强的亲水性或疏水性; 足够的使用强度。,这是一个比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件，能充分分离油水，使空气达到较低的相对适度下进入过滤器，以提高过滤效率。,1. 两级冷却、分离、加热除菌流程,三、几种典型的空气净化流程,特点：两次冷却、两次分离、适当加热。 优点：能提高传热系数，节约冷却用水，油水分离得比较完全。,经第一冷却器冷却后，大部分的水、油都已结