检测技术及梅毒实验室检测技术

1、艾滋病检测技术,广州医科大学附属第五医院检验科 詹铀超,窗口期,HIV感染后的血清学动态,Anti-P24,HIV RNA,感染 1周 2周 3周 4周1年 2年 3年.1 0年.,急性期,潜伏期,Anti-gp41/120 (anti-gp36),Ag,艾滋病期,Ab,浓度,试验室假阴性报告的原因分析,窗口期,非典型血清学转换,病毒变异,实验室误差,实验室进行艾滋病抗体筛查很很多的原因可能造成漏检, 曾经有文献具体分析过造成漏检的原因, 主要原因有因为窗口期的原因造成漏检, 因为病毒变异以及实验室误差等原因造成的漏检. 其中最主要的原因是因为窗口期的问题造成的漏检. 占整体比例的93.7%.

2、,筛 查 试 验,复 核 检 测,确 证 试 验,检测程序及流程图,HIV抗体筛查检测流程,酶联免疫吸附试验（ELISA） 化学发光法 快速检测及其它检测 明胶颗粒凝集试验（PA） 免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 电化学发光试验 其它快速筛查试验方法 艾滋病唾液尿液检测试剂,初筛检测方法,酶联免疫试验 ( ELISA ),最早用于检测血清中HIV抗体的有效筛检方法； 很高的敏感性和特异性； HIV抗体检测试剂根据其抗原的来源和检测方式可分为四代； 根据检测方法，可分成四类间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法。,（1）胶体金（胶体硒）法 （2）明胶凝集法 （3）

3、斑点印迹试验 （4）电化学发光法,快速检测方法,（1）胶体金法,原理：采用双抗原夹心法免疫测定原理，使用纯化HIV-1/2基因重组抗原，分别固定于硝酸纤维膜上，作为检测线，并且用这些抗原标记胶体金。当待检样本中存在HIV抗体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用向前移动，当遇到膜上固定的抗原时，形成Ag-Ab-Ag-AU复合物而富集在包被线上，形成一条或二条红色线，是阳性结果。反之，若标本中不存在HIV抗体，则不会出现红线，是阴性结果。无论样本中是否含有HIV抗体，在质控线区域都会形成另一条红色线。,T-检测线,C-质控线,第四代试剂联合检测HIV P24抗原和抗HIV 抗体,电化学发光法,第一

4、代艾滋病抗体检测试剂检测的是HIV-1 的IgG抗体, 检测的窗口期大约是42天. 第二代试剂可以检测HIV-1和HIV-2型的IgG抗体窗口期缩短至35天. 第三代的试剂可以同时检测IgG和IgM抗体, 将检测的窗口期又缩短至22天. 第四代的可以联合检测HIV的P24抗原和HIV-1/2型抗体的试剂, 大约平均比较第三代试剂缩短6天时间.,Elecsys HIV Combi 的检测原理,罗氏第四代HIV Combi试剂检测的是HIV P24抗原和HIV-1/HIV-2抗体.检测P24抗原使用的是单克隆的HIV 抗体. 检测HIV-1/2抗体使用的是大量的重组抗原,来捕捉IGg和IGM 抗体

5、.,钌,生物素,辣根过氧化物酶标记的磁性珠,电化学发光,快速检测法的优先使用,技术角度需要考虑： 需要快速得到结果、免去试剂和样本的冷链运输环节、小空间实验室的成本效益、检测的简单性等。 优先使用包括： 应急、门诊急诊，如VCT、母婴传播、临床评估、农村血检、术前检测、紧急事件等。,HIV快速检测的局限性,一般不用于血液筛查 有一定的假阳性反应 窗口期问题：有一定的假阴性反应（尤其暴露时间3个月）HIV抗体快速检测具有快速优势，但是“快速”并不意味着对早期感染者的快速诊断，因为HIV感染后产生抗体应答需要一段时间，存在窗口期（即从暴露至最早检测出的时间），即使采用分子生物学试验，也有12周的窗

6、口期。,阴性报告“HIV抗体阴性” 阳性出具“HIV抗体待复查”报告 （1）不能出阳性报告。 （2）同时尽快进行以下处理： 在广州市疾病预防控制中心数字化信息系统填写送检病例信息，打印送检单，重新采血，两份血和纸质版送检单一并送筛查中心或确证实验室； 做检测后咨询； 初筛阳性告知。（注意告知技巧）,筛查检测结果的报告和处理,抗体筛查试验的局限性,阳性结果需用其他试剂复查以及确证。 阴性结果有时不能排除HIV感染: (1)在感染早期，血清阳转前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗体可能检测不到（如p24抗体）。 (2)反应中抗体过量，抗原抗体比例不合适而不能形成特定结构，出现凝集抑制。,艾滋病实验

7、室生物安全,生物安全细则 职业暴露的防范,梅毒实验室检测技术,广州医科大学附属第五医院检验科 詹铀超,主要内容,实验室检测注意事项及临床意义 梅毒实验室检测策略探讨,常用梅毒实验室检测方法,病原学检测 血清学检测,病原学检查,原理： 一期、二期梅毒时 ，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。 方法：（1）暗视显微镜检查 （ 2）镀银染色法 （ 3）核酸检测（血液标本？） 注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功， 仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增

8、殖。,梅毒血清学检测方法,1) 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 （非特异性梅毒抗体） (2) 梅毒螺旋体抗原血清学试验 （特异性梅毒抗体）两类方法。,非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理,梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。 未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。,非梅毒螺旋体抗原血清学原理,方法包括： （1）快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR) （2）甲苯胺红不加热血清试验（ TRUST ） （3）性病研究实验室试验 (VDRL) 等。 基本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇

9、抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见 上述方法的敏感性和特异性都基本相似,非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图,非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点,1 、仪器：水平旋转仪，转速100r/min，转幅约18mm 2、定性试验 加样：吸取0.05mL血清( 浆) 放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内 加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1 滴抗原（ 60滴/mL，1滴=17ul ） 反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 - 29 ）亮光下观察结果。,非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点,3、定量试验 稀释夜准备：在反应纸板圈内 加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开 加样

10、：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。 下同定性实验。,1:1,1:2,1:8,非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义,早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后 一期梅毒 1 年后转为阴性 二期梅毒 2 年后转为阴性。 晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50% 病人血清反应仍为阳性。 非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。 因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。,非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点,假阳性反应 技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可排除。 生

11、物学假阳性反应 ( 一般滴度小1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验 如TPPA等进行排除。,梅毒螺旋体抗原血清学试验原理,抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。 感染梅毒螺旋体后 ，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。,梅毒螺旋体抗原血清学试验方法,梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA) 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) 梅毒酶联免疫吸附试验（ ELISA） 化学发光免疫分析法（CLIA） 梅毒免疫层析法- 梅毒快速检测 (RT) 荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS ） 梅毒螺旋体蛋白印迹试验（ WB ）,TPPA,TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性和特异性。 TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清