分子生物学大实验-生科专业15学时.ppt

1、07级生物科学专业 2009.8,分子生物学大实验,课程特点,时间长，集中，强度较大； 操作要求高，涉及的基本操作技能技巧较多； 实验中将接触一些有毒试剂（如E.B.和氯仿）。,课程要求,掌握实验原理，实践、熟悉并规范分子生物学主要的技术操作，学习药品及培养基配制方法。 实验前充分做好预习和各种准备，熟悉实验指导中的实验操作过程，准备一个实验记录本； 穿实验服，实验操作认真仔细，小心有毒药品的使用； 组内做好安排和协调，相互协作，互相谦让； 遵守时间，遵守纪律，不在实验室内大声喧哗，不做与实验无关的事情。,分子生物学主要技术,DNA、RNA的提取 质粒DNA的提取 感受态细胞的制备及质粒DNA

2、重组、转化和筛选 DNA酶切 PCR 核酸及蛋白质杂交,1、质粒DNA的提取及其酶切检测 质粒DNA提取技术（碱裂解法） 限制性内切酶酶切技术 电泳技术（琼脂糖凝胶电泳） 2、聚合酶链式反应（PCR） 反应体系的构建 反应程序的设计 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测,实验内容,质粒DNA的提取及其酶切检测,质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。,质粒复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。 质粒分为严紧型和松

3、弛型，我们现在使用的许多质粒（如PUC系列）多属松弛型质粒，能复制到很高的拷贝数，只要将培养物放在合适的培养基中生长到对数晚期，就可以用于质粒提取。,掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理； 掌握质粒DNA的中小量提取方法； 掌握限制性核酸内切酶酶切DNA的原理和方法； 掌握质粒DNA酶切分析的方法。,实验目的,实验原理,本实验利用碱裂解法中量提取质粒DNA。在NaOH/SDS等作用下，细菌细胞壁遭到破坏，使DNA从细菌中释放出来。在碱性条件下，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，将pH值调至中性，并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的

4、作用下形成沉淀，而质粒DNA由于处于拓扑缠绕状态，能够迅速重新形成可溶性分子。通过离心，可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，而质粒DNA仍留在上清中，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。 限制性核酸内切酶是基因工程中最常用的工具酶。其作用特点是特异识别DNA分子中的碱基序列（一般为4-6个碱基对的反向重复序列），酶切后产生平齐末端或粘性末端。 本实验采用EcoRI酶切提取的质粒pUC19。,克隆载体pUC19质粒图谱,试剂 LB液体培养基 STE溶液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris.Cl，1mmol/LEDTA pH8.0 溶液I：50mmol/L葡萄糖，25

5、mmol/LTris.Cl，10mmol/LEDTA pH8.0 溶液II：0.2mol/LNaOH，1%SDS，现用现配（0.4mol/LNaOH和2%SDS 等量混合）。 溶液III：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml 氯仿：异戊醇=24：1 无水乙醇 70%乙醇 10限制酶缓冲液 限制酶EcoRI pUC19,实验方法,仪器设备 恒温摇床、水浴锅、台式高速离心机、微量加样器、超净工作台,琼脂糖凝胶电泳试剂和仪器见其实验,1、从选择性培养基平板上挑取单菌落，移至含有相应抗生素的10mlLB液体培养基中，于37振荡培养过夜。 2、将培养物转移到一个15mL的试管中

6、，4000rpm离心10min。 3、弃上清，将细菌沉淀重悬于1mlSTE溶液中，剧烈振荡，充分悬浮，将悬浮液转移到1.5ml离心管中， 8000rpm离心5min。 。 4、弃上清，将细菌沉淀重悬于200ul预冷的溶液I中，剧烈振荡，充分悬浮。 5、加400ul新配制的溶液II到悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，混合内容物，将离心管置于冰上。 6、加300ul预冷的碱裂解液III，盖紧管口，反复颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上3-5min。,实验步骤,7、8000-10000rpm，4离心5min，转移上清（约600ul）到一新的离心管中。 8、加等体积的

7、氯仿（酚：氯仿），通过剧烈振荡混合有机相和水相，8000-10000rpm，4离心2min，转移上清到另一离心管中。 9、室温下加入600ul异丙醇以从上清中沉淀核酸，剧烈振动混合液，于室温下放置2min。 10、 8000-10000rpm，离心5min，收集核酸沉淀。 11、小心弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，将液体吸干，加1ml70%乙醇洗涤沉淀。 12、 8000-10000rpm，离心2min；小心弃上清，将离心管置于超净台上吹干。 13、用100ul含有（20ug/ml）RNaseA的TE溶液重新溶解核酸，温和振荡，37保温40min。（略） 14、取20ul电泳观察并照相。 （略

8、） 15、加灭菌双蒸水，将体积补至1ml，重复步骤7-12。 （略） 16、将沉淀溶于60-100ul灭菌双蒸水中，取5ul进行酶切分析（2份），取20ul电泳观察并照相。,17、取0.2ml离心管，配制酶反应混合液，每20ul反应体系包含： 10限制酶缓冲液 2ul 限制酶EcoRI 1ul ddH2O 12ul 混匀。 18、加入5ul pUC19，混匀（离心机） 。 19、37保温30-45min。 20、加入上样缓冲液，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果（以未酶切质粒做对照）。,聚合酶链式反应（PCR）,实验目的,掌握PCR原理 掌握PCR反应体系构建、反应程序设计及扩增产物检测的方法。,

9、实验原理 在目的基因两端人工合成两段已知序列的寡核苷酸引物（通常两个引物序列不同），分别与模板DNA进行加热变性，随之将反应混合液冷却至某一温度，使引物与它的靶序列复性，复性引物在DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）作用下，以四种脱氧核苷酸为底物，以待测目的基因为模板，得到延伸。 如此反复进行高温变性、低温退火和中温延伸（denaturation-annealing-polymerization）三个步骤，模拟生物体内DNA复制扩增过程（一般25-30cycles）。每个循环扩增产物又可作为下一个循环的模板，因此理论上每完成一个循环，特定DNA片段的分子数目增加一倍，多轮扩增的结果使目的DNA

10、片段以指数方式迅速积累，从而得到大量目的基因的新拷贝。,试剂 10buffer 4dNTP 引物1、2、3 Taq酶 模板DNA -EcoT14I DNA Marker -Hind III Marker,实验方法,仪器设备 离心机、PCR仪、微量加样器,1、配制Mix：每一50ul反应体积包括： 10PCR buffer 5ul 4dNTP Mixture 4ul 引物1（Control Primer 1） 0.5ul 引物2/3（Control Primer 2/3） 0.5ul Taq酶 0.25ul ddH2O 38.75ul 充分混匀。 2、加入模板(Control Template)

11、 DNA1ul，轻缓混匀，轻微离心。,实验步骤,3、放入PCR仪，按以下条件进行PCR反应。 使用引物1、2时（扩增6，012bpDNA片段） 循环： 94 45sec. 94 30sec. 55 30sec. 30Cycles 72 4min. 72 1min. 4 使用引物1、3时（扩增500bpDNA片段） 循环：94 30sec. 94 30sec. 55 30sec. 28Cycles 72 30sec. 72 30sec. 4 ,预变性,后延伸,4、PCR产物鉴定：加入上样缓冲液，混匀，离心，取10ulPCR产物电泳。-EcoT14I Marker和-Hind III Marker

12、做对照。,预变性,后延伸,DNA分子在碱性环境中（pH8.3 buffer）带负电荷，在外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率不同，从而可以区分不同的区带。电泳后经溴乙锭（E.B.）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。溴乙锭检测DNA灵敏度很高，10ng或更少的DNA即可检出。 线性DNA在凝胶中迁移距离（迁移率）与它的分子量大小的对数成正比。将未知大小DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物（DNA Marker）的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。,实验原理,附：琼脂糖凝胶电泳实验,1、用胶带

13、或插板封住塑料托盘开放的两边形成一个模具，置于水平工作台上，将梳子插入模具，梳子距模具一端约1cm，梳齿底端距托盘表面保持0.5-1mm的间隙。 2、称取0.4g琼脂糖置于三角瓶中,加入40ml TAE buffer以配制1%的凝胶，使用电炉子加热直至琼脂糖完全熔化，期间轻轻摇匀。 3、待琼脂糖冷却至65左右(滴入E.B. 至终浓度为0.5g/ml，轻轻摇匀，避免产生气泡)，小心缓慢倒入模具内（避免产生气泡），使凝胶缓慢展开直至在托板表面形成一层约3mm厚的均匀胶层，室温下静置0.5-1h。 4、待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出梳子（注意切勿使样品槽破裂），在胶板上形成相互隔开的样品槽。,实

14、验方法,5、将凝胶连同托板放入电泳槽平台上，倒入适量TAE buffer直至浸没过胶面2-3mm，小心除去样品槽中的气泡。 6、用微量加样器取样品（或DNA Marker）20ul，取6loading buffer 5ul，与样品（或DNA Marker）缓慢混合均匀（避免气泡），将混合样加入样品槽内（注意避免因样品过多而溢出，污染邻近样品）。 7、加入样品后，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳，在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm（电压值V/电泳槽两极之间距离cm）。 8、当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。 9、将电泳后的胶板小心推至含0.5ug/mlE.B.染色液中，室温下浸泡染色30min（略）。 10、小心取出凝胶并用水轻轻冲洗表面的E.B.溶液（略），然后将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯台上的保鲜膜上，在波长254nm紫外灯下进行观察。,11、DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，荧光