IPTG诱导的外源蛋白表达.ppt

1、IPTG诱导的蛋白表达调控，操纵子(operon ) :由原核生物中一些功能相关的结构基因串联组成的一个基因表达协同单位(DNA序列)，一个操纵子=编码序列(2-6)启动序列操纵子序列(其他调节序列) IPTG (isopropylthiog-alactoside ) :化学合成的乳糖类似物、强半乳糖苷酶诱导剂、乳糖操纵子(lac operon )的开放、诱导类似的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷酶)也人工化学合成IPTG和X-gal广泛应用于分子生物学和基因工程的工作。 IPTG的作用原理是乳糖操纵子，大肠杆菌利用乳糖，将乳糖放入细菌中的乳糖透过酶和催化乳糖分解的第一阶段的半乳糖

2、苷酶2种以上酶的环境中没有乳糖和其他半乳糖苷酶时，大肠杆菌合成半乳糖苷酶量极少，添加乳糖等23分钟后细菌大量合成半乳糖苷酶量提高一千倍以上，以乳糖为唯一碳源时，菌体内的半乳糖苷酶量占细菌总蛋白量的3% 、1乳糖操纵子、乳糖操纵子包含3种结构基因。 基因表达产物是-半乳糖苷酶，催化乳糖转化为不同乳糖(allolactose )，分解为半乳糖和葡萄糖的基因编码半乳糖透过酶，使环境中的乳糖进入细菌的基因编码转乙酰酶，使半乳糖乙酰化、1乳糖操纵子(lac operon )、1乳糖操纵子(lac operon )、在基因5侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点(RBS )特征的山大(SD，三个基因头尾结合，前

3、一个基因的翻译终止代码是下一个基因的翻译开始代码相同的核糖体沿该转录生成的多聚胱氨酸mRNA移动，翻译合成前面的基因编码的蛋白质后，继续沿mRNA移动合成而不从mRNA掉落，如1乳糖操纵子、2乳糖操纵子乳糖操纵子中，控制基因lac I位于Plac附近，有其启动子和终止子，转录方向与结构基因组转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的控制蛋白r。2乳糖操纵子负控制、2乳糖操纵子负控制在大肠杆菌生存于无乳糖环境时，lac操纵子处于阻断状态。 该基因在其自身的启动子Pi调控下，通过低水平、组成表达产生抑制蛋白r，每个细胞仅维持约10分子的抑制蛋白。 r以四聚体形式与操纵子结合，阻碍RNA聚合酶与启

4、动子Plac结合，阻止基因转录启动，阻止这些基因的表达。2乳糖操纵子负控制，2乳糖操纵子负控制，如果环境中有足够的乳糖，乳糖在半乳糖酶作用下变为另一乳糖，另一乳糖与r结合，改变r的空间结构，解四聚体2乳糖操纵子的负控制是，在这个过程中乳糖(实际工作的是不同的乳糖)是诱导剂，结合r发挥耗尽作用，利用乳糖开放酶类基因的转录，3乳糖操纵子(lac operon ) 3乳糖操纵子(lac operon )的正控制是，细菌中有可与cAMP特异性结合的cAMP受体蛋白CRP(cAMP receptor protein )，CRP不与cAMP结合时为惰性，cAMP浓度上升时3 -乳糖操纵子正控制和3 -乳糖

5、操纵子正控制具有这样的序列，其中一些序列在lac操纵子的启动子Plac上游端部分地与Plac重叠，可以与CAP特异地结合，并且可以与CAP结合位点(CAP结合位点) 相反，如果葡萄糖可以分解利用，则cAMP浓度降低，CRP不被活性化，lac操作子的结构基因表达降低。 由于对3乳糖操纵子(lac operon )的正控制是Plac弱的启动子，因此，由于乳糖的存在，仅使lac操纵子转录开放，细菌不能很好地利用乳糖，同时，如果CAP不增强转录活性，细菌就足以利用乳糖lac操作子的强制诱导需要乳糖的存在和葡萄糖的利用。 根据这个机制，细菌优先利用环境中的葡萄糖，只有在没有葡萄糖有乳糖的情况下才利用乳糖

6、。 3乳糖操纵子(lac operon )的正控制是CAP结合位点是一种发挥正控制作用的操纵子，CAP是转录中发挥正控制蛋白激活蛋白，编码CRP的基因也是一种控制基因CAP作用于几个操纵子，如前所述，乳糖操纵子是诱导操纵子，这种操纵子通常断开，效果作用时诱导开放转录。 这种操作符使细菌能够适应环境的变化，最有效地利用环境能够提供的能量基质。 3乳糖操纵子在外源蛋白表达中的应用，用乳糖操纵子调控外源蛋白表达的目的：需要大量繁殖菌体时，需要关闭外源基因，以便提供更多的物质和能量以确保菌体的正常快速生长。 菌体浓度达到要求时，诱导可在菌体中表达大量外源蛋白质。 3乳糖操纵子在外源蛋白表达中的应用是将

7、乳糖操纵子的调控基因lac Iq和启动子Plac插入我们使用的PGEX载体中，然后将GST基因外源基因插入。 这些基因头尾相连，由于前面的基因的翻译终止代码接近下一个基因的翻译开始代码，所以相同的核糖体沿着通过该转录生成的多顺序逆子mRNA移动，在翻译合成前面的基因代码的蛋白质之后，不从mRNA掉落而继续向mRNA vector information、MCS region、3乳糖操作子在外源蛋白表达中的应用，3乳糖操作子在外源蛋白表达中的应用，IPTG诱导的表达载体必须以过表达lac抑制物的大肠杆菌为宿主，阻止外源基因诱导前的转录。 由于多数IPTG诱导的表达质粒拷贝数高(30600 )，所以阻断基础表达(漏出表达)需要过剩的抑制物质。单拷贝的lac Iq等位基因可表达10倍的lac抑制物，但如果外源蛋白对宿主的毒性非常强或质粒拷贝数非常高，则需要将lac Iq等位基因克隆到表达质粒中，以确保紧密调节。 3乳糖操纵子在外源蛋白表达中的应用，IPTG诱导的条件：一般：0.5mM 28