昆虫分子鉴定技术简介.ppt

1、昆虫鉴定的分子生物技术,魏丹丹 副教授, 2016-5-31,一、昆虫主要的分子鉴定技术,1、分子鉴定技术的必要性,昆虫已命名100多万种，占动物界已知种类的2/3。,自林奈创立双名法近250年来，仅有100多万个昆虫物种被命名，而昆虫数量巨大（1000-2000万未鉴定），单靠专业的经典分类学家命名，几乎是不可能完成的任务。 以平均一个经典分类学家一生鉴定 1000 个物种的标准来计算，需要1万多个经典分类学家同时参与完成。,一、昆虫主要的分子鉴定技术,1、分子鉴定技术的必要性,由于经典分类学方法具有局限性（专业技术要求高，相对专一性），很难同时有效地对某一个地区某一个项目或某一次大型考察所

2、得到的全部生物样本进行鉴定与记录。 对形态学分类固有的缺陷，如表型可塑性和遗传可变性，无法鉴定隐存分类单元和不同发育阶段的昆虫。,一、昆虫主要的分子鉴定技术,1、分子鉴定技术的必要性,现有物种正以每年约1万种的速度在灭绝，也亟需一种更加具有效率的生物物种鉴定与记录体系。 以现在人类社会生产力发展的需求来看，亟需一种更加具有效率的昆虫物种鉴定体系，更好地为生产生活服务。 分子鉴定技术能够从不同发育时期的昆虫标本或残缺的组织中鉴别出物种。,二、昆虫DNA条形码,1、DNA分类,Tautz于2002年提出DNA分类的概念（DNA Taxonomy），以DNA序列为基础建立物种识别体系，利用DNA序列

3、的差异进行种级阶元的分类，并与林奈命名系统一一对应。（可以解决一些形态学上的难题，发掘隐存种）,二、昆虫DNA条形码,2、DNA条形码,理想的DNA条形码应符合一些基本标准: (1)具有足够的遗传变异性和一定的分化度，可以区分不同的物种，同时种内变异小，具有保守性。(2) 必须是一段标准的DNA片段来尽可能的鉴别不同的分类群。(3)目标 DNA 区应该包含足够的系统进化信息，用以定位物种在分类系统中的位置。(4)具有高度保守的引物设计区，便于通用引物的设计。(5)目标 DNA 足够的短，便于DNA的提取和PCR的扩增。,二、昆虫DNA条形码,2、DNA条形码,Herbert等于2003年提出D

4、NA条形码概念（DNA Barcoding） 。利用线粒体cox1基因（线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因，5端648 bp）作为通用序列，建立全球性的物种鉴别系统。,从理论上讲，15 个碱基位点就有415种编码方式，这个数目是现存物种的100倍。在蛋白质编码基因中的第3 位密码子碱基是可以自由变换的。因此，只需一段45个碱基长度的序列便可编码近10 亿的物种， 所以理论上 DNA 条形码这段648 bp 的序列完全可以鉴定所有物种。,cox1,相对保守又有足够的变异，并且序列长度适中。,该基因不存在内含子，是蛋白编码基因，所以便于比对，且可通过翻译检测错误，极少出现重组、 插入和缺失。,UEA5

5、/UEA6、UEA7/UEA8和UEA5/UEA8：相对保守高水平（科、属、种）系统发育研究 UEA3/UEA4 (or UEA4d) 和UEA9/UEA10：较为变异种群遗传学研究（种内或近缘物种系统发育）,2、DNA条形码,预先收录已知物种的cox1基因-建立数据库-未知种名物种cox1输入检索-据相似度鉴定物种。 DNA条形码的操作流程主要有以下几个步骤：1)标本采集、整理、鉴定、描述；2)基因组DNA提取；3)DNA条形码标准基因的PCR扩增；4)PCR产物纯化及DNA序列测定；5)DNA 序列比对与分析。,DNA提取试剂盒；个体微小的样品，采用传统的CATB法、SDS法更为有效；个体

6、较大的昆虫一般选用线粒体含量丰富的特定组织，需要整头提取的虫体，特别是捕食性昆虫，建议解剖捕食者以获取不受污染的组织碎片。,存在的PCR抑制物质的样品，可 通 过 加 入 少 量 牛 血 清 蛋 白、Q-solution(Qiagen，德国)或洗涤样品、稀释 DNA 等方法降低抑制作用。,DNA 序列比对与分析,序列分析即利用生物信息学软件统计分析序列差异，主要包括进化树法（tree based methods）、距离法（distance based methods）和特征法（character based methods），前两者主要包括邻接法、BLAST搜索或使用软件分析碱基遗传距离等，后

7、者主要包括DNA序列中核苷酸的组成、替换与缺失等分析。在分析种以下水平的序列差异时，由于基因距离较小，使用基于特征的分析方法更为可靠。,DNA 序列比对与分析,进化树法,通过构建系统发育树，以进化树上的物种是否为单系性为标准来判定未知物种的种类或发现新种。常用方法有邻接法（NJ）、最大简约法（MP）、最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）。 MP、ML法和BI法是基于特征的方法，通过比较所有序列的每个位点，计算每棵树的得分。NJ法为基于一定的进化模型，如：K-2-P模型、p-distance等，计算出各序列间的遗传距离，构建距离矩阵，进而构建系统发育树。,DNA 序列比对与分析,距离法,距离法是

8、通过计算物种间的遗传距离来鉴定物种，根据条形码间隙的概念，即种内遗传距离和种间遗传距离之间应存在一个距离间隙，或通过定义一个能区分种内、种间遗传距离的阈值，将未知物种鉴定为已知物种或定义为新种。 TaxonDNA是基于遗传距离分析条形码鉴定效率的程序（评价方法：最佳匹配方法（BM）和基于阈值的最佳匹配方法（BCM）。通常基于K-2-P模型进行计算。BM方法的常会导致假阳性的错误鉴定；BCM有所改进，该方法先对数据库中的序列进行统计分析，得出一个相似性的阈值，即与未知序列遗传距离最小且在阈值范围内的数据库中的物种为鉴定成功的物种。,DNA 序列比对与分析,特征法,特征法是寻找某分类单元内成员共享

9、、并可以将其与其他分类单元区分开的鉴定特征。一个物种中的固定核苷酸位点的固定碱基可以作为鉴定该种的诊断特征，类似于传统分类学中的形态特征，来鉴定和描绘物种。该方法已被证实为物种鉴定的有效方法。,特征法-木蠹象属昆虫DNA条形码检测技术的研发,木蠹象属昆虫的鉴定特征（cox1基因片段长度 371 bp）,利用基因条码分析软件共检测到 46 个多态位点，其规律作为木蠹象属昆虫的鉴定特征，可以根据特征对该属物种进行准确鉴定。标记性碱基的确定为木蠹象属昆虫的分子快速鉴定提供了实验依据。,榛梢木蠹象Pissodes terminalis在数据库里的比对结果1,榛梢木蠹象Pissodes terminal

10、is在数据库里的比对结果2,/,2007年5月，加拿大圭尔夫大学正式筹建生命条形码数据库系统(Barcode of Life Data Systems，BOLD)。包括序列信息，也包括完整的物种描述、地理分布信息、标本图片等。,以每年30 万个样本的速度在扩充,截至2015年3月，已有DNA条形码序列3,866,134条，包括157,057种动物、62,025种植物和16,837种真菌及其他生物类群。,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,已经开展的昆虫 DNA 条形码计划,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,在昆虫分类学中的应用,鉴定物种：在双翅目

11、、膜翅目、鞘翅目、蜉蝣目、弹尾目、直翅目、蜻蜓目、缨翅目、襀翅目和毛翅目等中DNA条形码也被证实可以很好地区分物种。 确定虫态关系：可以对通常形态上无法鉴定的尤其是完全变态的幼虫、蛹、卵等虫态进行分类。,最基本的用途就是物种间的相互区别和新物种的发现。其他用途均是由这两个用途衍生出的。,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,在昆虫分类学中的应用,发现隐存种与合并异名种：在鳞翅目等类群中，通过DNA条形码发现了大量隐存种或新种（Hebert等在发现 DNA 条形码序列差异后结合幼虫色型、幼虫取食植物、生态分布、成虫头部等特征发现，双带蓝闪弄蝶其实是个由同域分布的至少10个种组成的复合体。）,DNA条

12、形码技术在昆虫学中的应用,在昆虫分类学中的应用,探讨系统发育关系：尽管DNA条形码的目的不是为了构建系统发育树， 但是条形码所使用的 COI 基因本身就包含着一定的系统发育信息， 通常认为可以用来探讨一些低级阶元的系统发育关系。,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,在昆虫分类学中的应用,分析区系组成：如利用DNA条形码技术对罗马尼亚的鳞翅目1387个标本的种类进行全面分析，最后得出6 科 180 种的结果。,在昆虫生态学中的应用,确定寄生关系：明确生态系统中种间寄生关系（主要是植食性昆虫与寄主植物间的关系、 寄生昆虫与寄主的关系等）是生态学研究与昆虫管理中的重要问题。Smith等检验了条形码用于

13、研究寄生蝇类的可行性，先用形态方法对哥斯达黎加西北部的关纳卡斯帝保护区中寄生于鳞翅目幼虫的寄生蝇类进行鉴定，得出20 个形态种，然后再用 DNA 条形码的方法重新鉴定， 结果不仅区分出了其中17 个具有高度寄主专一性的形态种， 还揭示出剩余的 3 个表面上杂食性的形态种其实都是由具寄主专一性的物种组成的隐存种。,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,在昆虫生态学中的应用,解析食物链：通常是通过特异的引物检测植食性昆虫或捕食者肠道内含物或排泄物中残存的寄主植物或被捕食者的 DNA 来确定食物链中的营养关系。如Kaartinen等首次应用 DNA 条形码 COI 和ITS2 序列研究了发生在黑橡Que

14、rcus robor Linnaeus上的潜叶鳞翅目和造瘿膜翅目组成的食物网中的物种成员以及相互的关系。,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,在昆虫生态学中的应用,推断气候变化对昆虫的影响：如通过形态结合 DNA 条形码的方法调查20 世纪中期及其5070 年后加拿大极地Churchill地区的一些寄生蜂的多样性，并比较这两个时期的物种多样性的改变，结果发现在这5070年间，这些地区的物种组成确实随着温度的升高发生了显著的变化。,在应用昆虫学中的应用,农业昆虫学：上述 DNA 条形码技术在昆虫分类与生态学研究中应用的很多方面均可用于农业昆虫学研究中。如利用 DNA 条形码对北美农业生态系统中的天

15、敌昆虫瓢虫种类进行了分析，发现3种本地物种和2 种入侵物种。 植物检疫：随着参考序列数据库的不断完善， 条形码可用来作为全球范围内快速准确鉴定外来入侵物种的通用方法。,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,在应用昆虫学中的应用,城市昆虫学：关于城市化昆虫的进化起源及其特点已经开始受到越来越多学者的关注。如通过利用 DNA 条形码对美国47个地点家酸臭蚁样品进行生物地理学研究表明，每个城市的城市化种群都是由其周围自然环境中的蚂蚁入侵形成的，而非所有的城市化种群都有一个共同的起源。,法医昆虫学：法医昆虫学主要是利用尸体上产生昆虫的种类、生长发育情况来推断死亡时间、地点等，对昆虫进行准确鉴定是开展法医昆

16、虫学研究的前提。一般 成虫易飞走而导致通常收集到的都是卵、幼虫、蛹或者是残肢碎片，这些因为缺乏形态上的鉴定特征，致使传统的形态鉴定难以实现，以往主要的解决办法就是将幼虫带回去饲养成成虫后再鉴定，这种方法不仅会拖延大量的时间，而且经常会因为饲养经验不足， 环境不适应导致幼虫死亡，最后直接影响相关案件的侦破。,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,在应用昆虫学中的应用,保护生物学：用DNA条形码技术对候选保护区进行评估, 能全面反映整个生态系统的物种物种多样性、遗传多样性、系统发育多样性和进化潜力等, 使保护决策更科学合理（宏条形码技术）。,在一些生物多样性调查研究中，DNA条形码鉴定物种的准确率达到

17、了97%,该技术将整个混合样本的DNA片段扩增后再进行高通量测序，目前已用于微生物和动物的相关研究中。,DNA条形码技术在昆虫学中的应用,在应用昆虫学中的应用,保护生物学：此外，为执法部门的科学执法提供了强有力的保障，如利用DNA条形码还可以及时地检查出非法交易中受保护的濒临灭绝昆虫，如由鸟翼凤蝶 Ornithoptera spp制作的装饰品和一些珍惜鞘翅目昆虫标本。 医学昆虫学：为研究关于吸血性昆虫与其脊椎动物寄主的相互关系提供了一个快速通用的鉴定工具。如选取蚊、库蠓、锥猎蝽吸食的血液，结果鉴定出将近40种脊椎动物寄主，包括23 种鸟类、16 种哺乳动物以及1 种爬行动物。,3、相关争议问题

18、,抛弃传统分类方法，会造成分类学的倒退，分类学有可能又回归到依据单一性状进行分类的类型学。DNA 分类只是部分科学家的一厢情愿，并没有多少实际意义。仅用DNA 序列作为分类依据，会丧失很多有用信息，特别是颠覆了传统意义上的物种认知，使人们对物种的理解变成了抽象的代码。,3.1 DNA条形码与DNA分类的关系,目的不同： DNA条形码基于DNA序列之间的相似度进行物种鉴定，注重实效，而不是构建生命树或进行系统发育研究。而DNA分类则是要建立一个单独依靠DNA序列的分类系统（不依赖形态特征，能排除人为因素，更为客观，更接近物种的自然属性；为物种鉴定提供平台的同时，还需要进一步探讨物种的系统发育、高

19、阶元分类地位等深层次的内容）。,关于DNA条形码与分类学的关系，应是把条形码定义为一个有前途的技术工具，其作用应该是服务于分类学而不是取代分类学。,3.1 DNA条形码与DNA分类的关系,所用基因不完全相同： DNA 条形码强调用统一的基因序列进行鉴定（解决一些特殊类群，或处理一些特殊情况如假基因、基因交流等时，需要再加一条候补基因）；在DNA分类中，对于长度仅为658 bp的cox1基因来讲，所包含的信息量并不足以很好的解决物种的系统发育等问题。要进行更深层次的分类工作。一般仍需要再加至少一条其它区域的DNA序列（核基因），甚至还需要附加其它的性状（生态学、行为学等）来进行辅助研究。 分析方

20、法不完全相同：虽然 DNA 条形码主要用系统发育分析常用的树来做分析，但仅仅是为了验证物种的单源性和聚类关系，通常要求所用分析方法简洁、快速（这些树不能看做系统发育树）。而 DNA分类为了解决系统发育与高级阶元分类关系等问题，针对 DNA 序列的特点，可能要用到多种软件、多种算法构建系统发育树，运算耗时较长。,3.2 物种概念的定义,“生物学物种概念”（Mayr）：对于有性生殖生物而言，物种是一个具有共同基因库、与其它类群之间存在生殖隔离的类群。 物种形成是一个渐进的过程，何时确定为新物种形成，在分类实践中难以操作；物种形成是对不同自然环境或性选择的分化适应，生殖隔离是这种分化适应的副产物，因

21、而没有必要将生殖隔离作为物种形成的绝对标准。 DNA条形码：种内种间的线粒体cox1基因差异存在一个阈值（约2-3%）。（但在实际研究中，许多类群存在种内种间线粒体基因序列差异重叠的现象，而且各类群、谱系之间的阈值也不相同）。物种的形成是一个动态的、连续的过程，单用种内种间差异来进行物种定义不能准确将其表达。,3.3 DNA条形码面临的问题,进化速率：不同生物中的进化速率并不一致。太慢，则难以鉴别物种。 假基因干扰：核内的线粒体基因拷贝（ NUMTs）会影响DNA条形码的准确性。 种间线粒体基因交流：线粒体基因属于母系遗传，所以可能会出现一些导致错误鉴定的现象。（种间杂交和内共生体感染，杀雄微

22、生物和细胞质不亲和共生菌。沃尔巴克等内共生菌的存在，造成寄主mtDNA多态性降低或提高，从而影响DNA条形码及系统发育研究。） 取样的问题：浸泡标本给取样带来了困难，个体很小的标本，DNA提取将会完全破坏标本（微型条形码）；取样的范围过小和不均匀，会出现种内种间有差异阈值的现象存在（如果增加地理种和近缘种的干扰，DNA条形码鉴定的准确率就会下降）。 分析方法：DNA 条形码一般采用K-2-P模型（遗传距离值很小时的最佳模型，生物条形码联盟 ( CBOL) 推荐使用的遗传距离计算模型）计算种内种间距离。所用的系统发育分析方法有 NJ、UPGMA（非加权组平均法）、ML、MP、贝叶斯（BI）等。,

23、4、我国DNA条形码研究进展,2008年，中国科学院代表团与 iBOL 签订了合作谅解备忘录，使我国成为 iBOL四个中心节点之一，与加拿大、美国和欧盟具有同等地位。iBOL中国委员会，设立了南方和北方两个分中心。 优先启动农林害虫、药用昆虫、媒介昆虫、传粉昆虫、外来入侵物种、重要保护动物等具有重要经济及理论价值的类群。 总之，DNA条形码将在其基本功能(如储备数据、鉴别物种)、延伸功能(如构建系统发育关系、服务特定行业、编制新一代生物图志)以及潜在功能(如物种整合)等三类发挥作用。根据其研究尺度, 可划分出类群(主要是专科专属类研究)、群落(以自然保护区和大型固定样地构成的生物群落)和区域(

24、生物多样性热点地区)等三个水平。,三、基于ITS的昆虫分子鉴定,核糖体RNA (rRNA)是构成核糖体的主要成分，是最多的一类RNA，也是3类RNA（tRNA, mRNA, rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA，它与蛋白质结合而形成核糖体，实现蛋白质的合成。rRNA基因在真核生物基因组中以串联重复方式存在，其中18S、5.8S和28SrRNA 基因组成一个转录元件。 核糖体内转录间隔区（ITS）通常包括ITSl和ITS2，转录时，ITS1和ITS2就会被剪切掉，不参加核糖体的形成，因此受到的选择压力小，进化速度快，可用来研究种群分化、种或属间的系统发育。,三、基于ITS的昆虫分子鉴定,基于

25、ITS2特异引物进行书虱物种鉴定,多重PCR技术,四、限制性片段长度多态性,RFLP（restriction fragment length polymorphism）利用限制性内切酶消化不同个体的基因组DNA或某一基因，从而产生大小不同或数目各异的DNA片段。酶切片段可通过电泳（Southern印迹转移到支持膜上，利用同位素或非同位素标记的探针）来检测。这种差异是酶识别序列内的点突变或是部分DNA片段的插入、缺失、异位或倒位等原因造成的。,书虱 PCR-RFLP快速识别,借助1对引物16Sar/16Sbr 和1种限制性内切酶Dra I，通过 PCR-RFLP 技术可将我国常见仓储书虱即嗜虫书

26、虱、嗜卷书虱、无色书虱和小眼书虱进行识别。,五、随机扩增片段长度多态性,RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）是以PCR技术为基础的DNA分子标记技术，采用单一的人工合成的10 bp左右的随机引物，对总基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳分离，经染色后来检验扩增产物DNA片段的多态性。 而基于随机扩增多态性RAPD基础上转化出来的序列特异性扩区(sequence characterized amplified region， 简称 SCAR) 标记具有操作简便、 灵敏度高、成本低、 可用于样品大规模检测等优点， 在昆虫

27、鉴定中得到广泛应用。,六、实时荧光定量PCR技术,酶切熔解曲线分析法，即利用DNA片段GC含量不同，熔解曲线具有差异的特性，通过实时荧光定量PCR仪对目标产物进行快速扩增，结合快速内切酶酶切，产物进行熔解曲线分析，从而实现不需要进行凝胶电泳检测即可对任意SNP位点进行分型的目的。,一种新的SNP分型方法,酶切位点筛选及引物设计,DNA 提取、PCR 扩增,限制性内切酶酶切,熔解曲线分析,37 酶切 10 min 60 下 15 min 灭活,95 变性性15 s 60 温育1 min 6090 连续升温 （升温幅度 0.02 s1）,引物设计完成后在正向引物5 端加上一段长7或14 bp的GC

28、-clamp,六、实时荧光定量PCR技术,当PCR产物可被限制性内切酶切开，产生的两条酶切产物的GC含量会有不同，从而导致熔解曲线出现差异，形成双峰；而当PCR产物无法被切开时，酶切产物只有一种，熔解曲线为单峰。,当GC-clamp长度过短而PCR产物长度较大时，产物熔解曲线分离度较差，甚至与酶切前产物熔解曲线难以分开。当PCR 产物较短，产物GC含量不高时，短GC-clamp也可以导致明显的熔解曲线分离,六、实时荧光定量PCR技术,TaqMan-MGB探针设计：根据27种实蝇的条形码（cox1）单倍型序列比对结果，在每种实蝇各自的特异性引物范围内，人工寻找能与其他物种区分开的突变位点。结合TaqMan-MGB探针设计原则，在种特异性位点所在的位置设计探针。所设计的探针5端荧光报告基团标记为FAM（羧基荧光素）。 实时荧光技术方法的建立：通过对实时荧光反应体系和扩增条件的优化，可建立实蝇TaqMan-MGB探针两步法实时荧光鉴定技术方法，通过直接观察扩增曲线即可判断结果，设定CT 30为阳性扩增。,实时荧光技术在实蝇鉴定中的应用,5端第一个碱基不能为G； 3端