DNA复制是半保留式的.ppt

1、16脱氧核糖核酸复制，12.1脱氧核糖核酸复制是半保留的。12.2脱氧核糖核酸复制是双向的。12.3脱氧核糖核酸聚合酶催化复制叉的聚合。12.4脱氧核糖核酸聚合酶同时催化两条链的合成。12.5复制叉的移动需要多蛋白复合物。12.6脱氧核糖核酸复制始于细菌染色体上的唯一部分。12.7脱氧核糖核酸复制终止于第1区2.8脱氧核糖核酸复制的其他方式12.9受损的脱氧核糖核酸可以修复，遗传中心法则，脱氧核糖核酸复制，核糖核酸复制，转录，反转录，翻译，蛋白质，迈森-斯塔尔实验：1。大肠杆菌在仅含有氮源15N (15NH4Cl)的培养基中培养，并且所有合成的核苷酸含有15N，其具有高密度并整合到亲本DNA

2、2中。将生长在15NH4Cl培养基中的大肠杆菌转移到仅含氮源但密度低的14N (14NH4Cl)培养基中。培养两代，取每一代的DNA进行密度梯度离心。12.1 DNA复制模式是半保留的，先在15NH4Cl培养基中培养，然后转移到14NH4Cl培养基中，只在15NH4Cl、14N对照系统、15N对照系统中培养，第一代、第二代、DNA提取、密度梯度超速离心、大肠杆菌细胞、15N标记的亲本DNA，第一次复制在14N，第二次复制在14N，实验结果表明DNA复制是半保留复制，(a)DNA带密度梯度离心，和(b)解释从上图可以看出，在密度梯度离心后，在含14N氮源的培养基中培养的第一代细胞的DNA条带位于

3、15N培养基中的DNA条带之上。 在含14N氮源的培养基中培养两代后，密度梯度离心后出现两条条带。第一条带位于与培养区中的DNA带相同的位置，另一条带位于第一条带的上方，表明第二条带的密度较轻。实验结果充分证明了DNA复制是一种半保守复制。两种复制模式(a)单向复制模式(b)双向复制模式，12.2 DNA复制是双向的，大肠杆菌染色体DNA双向复制模式，复制起点，复制叉，复制叉，真核生物DNA复制有多个复制起点，同时双向复制，当DNA被合成时，核苷酸通过酶催化被添加到延伸的DNA链中，这需要一个完整的DNA链作为模板来合成一个。阿瑟科恩伯格(斯坦福大学医学院教授)和其他人在1955年开始寻找合成

4、脱氧核糖核酸的酶。1956年，在大肠杆菌的提取物中发现了脱氧核糖核酸聚合酶。科恩伯格发现的脱氧核糖核酸聚合酶现在是脱氧核糖核酸聚合酶，它是分子量为109，000的多肽链，具有聚合活性、3-5个核酸外切酶活性和5-3个核酸酶活性。后来，又相继发现了其他几种具有不同功能的DNA聚合酶。下表总结了迄今为止在大肠杆菌和哺乳动物中发现的DNA聚合酶的基本特征。12.3脱氧核糖核酸聚合酶催化复制叉的聚合反应，见P414；其中；Klenow片段：参见P416了解PolIII的结构和功能。聚合的基本过程是通过新合成的链的3-羟基亲核攻击新核苷三磷酸(使用d NTP)的磷，导致磷酸酯键断裂。结果，一个新的核苷酸

5、被添加到链的3-末端，也就是说，一个核苷酸被延伸。焦磷酸酶水解释放的焦磷酸有利于聚合反应，并有双重检查功能：选择DNA聚合酶；3-5核酸外切酶的校对功能。右图显示了“酶特异性对底物的校正反应”。详见P414415，因为DNA的两条模板链是反平行的，而且因为DNA总是在5-3个方向合成的，也就是说，两条新的链是在相反的方向合成的。换句话说，子链的合成方向与复制叉的运动方向一致，这个子链称为前导链；而另一个子链以与复制分叉相反的方向移动。这条链被称为滞后链，但它也是由5-3个方向的聚合形成的。12.4.1滞后链中的DNA合成是不连续的。根据冈崎实验，可以确定复制叉的一个“前导链”是c连续合成和不连

6、续合成的结合使得整个复制叉向一个方向延伸。12.4脱氧核糖核酸聚合酶同时催化两条链的合成，而甘奇片段、复制叉移动方向、前导链和滞后链，脱氧核糖核酸聚合酶同时催化两条链、前导链和滞后链的合成，12.4.2每个甘奇片段的不连续合成从一个核糖核酸引物开始，这解释了滞后链是如何合成的，但不能解释每个甘奇片段是如何开始合成的。脱氧核糖核酸聚合酶三不能从头开始聚合，它只能向现有的多核苷酸链中添加核苷酸。因此，为了合成滞后链，有必要在复制叉上合成一系列短的核糖核酸引物。每个核糖核酸引物与滞后链模板部分互补，并在脱氧核糖核酸聚合酶的催化下从引物的3-末端延伸形成冈崎片段。核糖核酸引物是由引发酶合成的，引发酶是

7、一种叫做引发剂的大型复合物的组成部分，引发剂还包括脱氧核糖核酸解旋酶的解旋酶和其他辅助蛋白质。起始酶催化长度约为每秒10个核苷酸的核糖核酸引物的合成。由于复制叉以每秒约1000个核苷酸的速度移动，每1000个核苷酸就合成一个核糖核酸引物。12.4.3脱氧核糖核酸聚合酶切断核糖核酸引物并延伸冈崎片段，脱氧核糖核酸聚合酶识别并结合到新的脱氧核糖核酸链的3个末端和下一个核糖核酸引物之间的切口上。然后5 3核酸外切酶活性催化第一个核糖核酸核苷酸的水解，而5 3聚合酶活性在新的脱氧核糖核酸链的3个末端增加一个脱氧核苷酸。这种同时降解和合成的过程称为缺口翻译。这样，切口沿着滞后链移动。切断核糖核酸引物并填

8、充缺口后，脱氧核糖核酸从脱氧核糖核酸中分离出来，留下由缺口(磷酸二酯键的缺口)分开的双链脱氧核糖核酸。最后，在脱氧核糖核酸连接酶的催化下，一个罡气片段的3-末端与另一个罡气片段的5-磷酸基团形成磷酸二酯键，合成了两个罡气片段。引发剂，引物酶，脱氧核糖核酸聚合酶，脱氧核糖核酸聚合酶，脱氧核糖核酸连接酶，滞后链，前导链，单链结合蛋白，解旋酶，12.5复制叉的运动需要多蛋白复合物，而复制叉的运动需要除脱氧核糖核酸聚合酶之外的至少四种其他蛋白进行聚合。主要蛋白质有解旋酶、拓扑异构酶、单链结合蛋白和DNA启动酶(也称为引物合成酶)。解旋酶：这是一种需要三磷酸腺苷的酶，在移动的复制叉前面沿着单链脱氧核糖核

9、酸滑动。大肠杆菌中最重要的解旋酶是脱氧核糖核酸，它是一种与引发酶紧密聚合的蛋白质。脱氧核糖核酸抗体使复制叉前面的双螺旋脱氧核糖核酸解偶联，这与核苷三磷酸的水解有关。拓扑异构酶和用于释放解旋酶作用后产生的扭转张力。脱氧核糖核酸的快速展开在复制叉上形成了一个超螺旋头。拓扑异构酶可以切割一条脱氧核糖核酸链并使其旋转，而拓扑异构酶可以切割两条脱氧核糖核酸链。单链结合蛋白(SSB):它的功能是在解旋酶的作用下，防止未扭转的螺旋回到其原始状态。它对单链脱氧核糖核酸有很高的亲和力，在延迟链合成开始时需要单链结合蛋白。当螺旋被拧开后，当前导链可以连续合成时，就不需要这种蛋白质了。脱氧核糖核酸启动酶：这种酶沿着

10、滞后链以规则的间隔合成短的核糖核酸引物。然后，在引物的3-羟基端沿5-3方向通过DNA pol III合成冈崎片段。核糖核酸引物可以被脱氧核糖核酸引物去除，然后用互补的脱氧核苷酸填充。在复制起点的前导链合成开始时也需要启动酶。脱氧核糖核酸连接酶(1967年发现):如果一条双链脱氧核糖核酸链有一个缺口，一端是3-羟基，另一端是5-磷酸，连接酶可以催化两端形成磷酸二酯键，从而连接缺口。但是它不能连接两条自由的脱氧核糖核酸单链。大肠杆菌和其他细菌的脱氧核糖核酸连接酶需要NAD提供能量，而高等生物和噬菌体需要三磷酸腺苷提供能量。T4噬菌体的脱氧核糖核酸连接酶不仅可以连接脱氧核糖核酸和模板链上的脱氧核糖

11、核酸链之间的切口，还可以连接没有粘性末端的钝双链脱氧核糖核酸连接酶的反应机制：NAD(三磷酸腺苷)-AMP烟酰胺单核苷酸(PPi)-AMP p-5-脱氧核糖核酸酶AMP p-5-脱氧核糖核酸-3-羟基AMP p-5-脱氧核糖核酸-3-o-p-5-脱氧核糖核酸AMP脱氧核糖核酸连接酶在脱氧核糖核酸复制、损伤修复中起重要作用，在重组过程中起重要作用等。脱氧核糖核酸复制图，复制品，在脱氧核糖核酸复制过程中，许多酶和蛋白质参与了脱氧核糖核酸的复制。复制子的基本活动包括：1)双链的解链；2)合成2)核糖核酸引物；3)脱氧核糖核酸链的延伸；4)切断核糖核酸引物，填补缺口，连接脱氧核糖核酸片段；5)错配碱基

12、的切除和修复。大肠杆菌是位于一个叫做oriC的基因位点的单一来源。oriC区域包含两种类型重复的多个拷贝。脱氧核糖核酸结合位点包含一个特殊的9碱基对重复序列(4个拷贝)，另一个位点是一个富含A-T13碱基对的重复区域(3个拷贝)(图A)。图b显示了oriC的复制开始模式。大约20个脱氧核糖核酸蛋白结合到9个碱基对重复区，并引起脱氧核糖核酸结构的变化，导致13个碱基对重复区的双螺旋变性。(见P422表34-4)富含A-T重复区的位点在定位复制囊泡中心中起作用。一旦该区域靠近其他的DNA复制蛋白，复制小泡在解旋酶和SSB的作用下向两个方向延伸，形成两个复制叉。然后，该酶被诱导合成核糖核酸引物，而脱

13、氧核糖核酸聚合酶开始合成前导链和滞后链。12.6细菌中的脱氧核糖核酸复制始于染色体上的唯一部分。大肠杆菌oriC结构模式：大肠杆菌OriC富含-T序列和4个9碱基对重复序列；b .在oriC复制最初的模式，在ter区有五个DNA序列(terA至terE)。序列排列在染色体上形成一个复制叉“陷阱”区域，复制叉可以进入但不能出来。顺时针方向的陷阱由terB和terC组成，而逆时针方向的陷阱由terA、terD和terE组成。陷阱区是终止子利用物质(Tus)的结合位点。Tus可以与每个ter组合。一旦三联体形成，复制叉的路径可以通过阻止解旋酶从脱氧核糖核酸上旋下而被阻断。Tus-ter复合体仅从一个

14、方向(顺时针或逆时针)捕获复制分叉，但对另一个方向(逆时针或顺时针)的复制分叉没有影响。终止区的布置可以保证从相反方向进入ter区的两个复制叉始终相遇，当一个复制叉与另一个复制叉相遇时，DNA复制完成。12.7脱氧核糖核酸复制终止于ter区，大肠杆菌的600kb ter区含有五个不对称的ter位点，每个位点都可以与Tus结合。箭头指示每个副本的可能终止位置。真核染色体通常比细菌染色体大得多。例如，大肠杆菌基因组是由4.6103kb组成的单一染色体，而真核生物通常包含一条以上的染色体，通常在20-30对染色体之间。虽然染色体数目的增加使基因组变得更加复杂，但所有生物体内复制DNA的生化机制基本相

15、似。真核生物的DNA复制具有以下特点：真核生物含有更多种类的DNA聚合酶。真核生物在复制叉中需要不同的辅助蛋白。真核生物像大肠杆菌一样，在两个方向上复制。然而，大肠杆菌染色体有独特的复制起点，而真核生物染色体有许多复制起点。12.8真核生物中的脱氧核糖核酸复制与原核生物中的相似，也是真核生物中脱氧核糖核酸复制的特征。1.真核生物有多个复制起点、多个复制眼、双向复制和多个复制因子。2.冈崎碎片约为200bp。3，真核生物的复制速度比原核生物慢。4.真核染色体在完全复制之前不会在起点再次复制。然而，在快速生长的原核生物中，起源可以持续启动复制。当真核生物快速生长时，它们通常采用更多的复制起点。5.

16、真核生物有许多种脱氧核糖核酸聚合酶。6.真核生物的线形染色体两端都有端粒结构，以防止染色体之间的末端连接。端粒酶负责填充切除后新合成的5RNA链引物，并保持一定长度的端粒。滚环复制：首先，在模板链上组装一个引发剂，合成核糖核酸引物。然后，在脱氧核糖核酸聚合酶的作用下，引物延伸形成互补链。产生的双链脱氧核糖核酸分子通过噬菌体编码的核酸内切酶在链上的特定位置产生一个缺口。最后，在脱氧核糖核酸聚合酶的作用下，该链从暴露的3个羟基开始延伸，取代原来的链。12.9其他的DNA复制方式，线粒体DNA的复制采用一种特殊的D环复制方式：环状双螺旋DNA在某一点解开并开始复制。然而，前导链和滞后链的起点不在同一

17、位置。首先，合成前导链，结果，一个链(滞后链模板)保持单链。形成一个d形环。当前导链合成到某一点时，滞后链的起点暴露出来，滞后链开始复制。逆转录病毒的基因组是核糖核酸分子，在感染过程中，核糖核酸分子可以反转录成脱氧核糖核酸分子。脱氧核糖核酸被重新翻译产生病毒核糖核酸，或者与宿主的脱氧核糖核酸分子结合，这样病毒就潜伏在宿主的后代中。逆转录酶是将逆转录病毒核糖核酸转化为脱氧核糖核酸的关键酶。该酶具有核糖核酸酶H活性(核糖核酸降解活性)和脱氧核糖核酸聚合酶活性。12.10逆转录酶以核糖核酸为模板，可催化脱氧核糖核酸合成、核糖核酸、核糖核酸-脱氧核糖核酸杂交、单链脱氧核糖核酸、双链脱氧核糖核酸、核糖核

18、酸的cDNA拷贝、逆转录病毒生命周期中的七个主要过程，以及逆转录病毒进入宿主细胞。在逆转录酶的催化下，以病毒核糖核酸为模板合成互补的脱氧核糖核酸，形成核糖核酸-脱氧核糖核酸杂交体。逆转录酶降解杂交体中的核糖核酸，并以剩余的脱氧核糖核酸链为模板合成另一条互补的脱氧核糖核酸链，形成双链脱氧核糖核酸。双链脱氧核糖核酸被整合到宿主脱氧核糖核酸中；利用宿主复制和转录机器产生大量的病毒核糖核酸；转录的基因被翻译成病毒的包膜蛋白、逆转录酶和衣壳蛋白。将病毒核糖核酸、逆转录酶和衣壳蛋白组装成病毒的核衣壳；核衣壳与包膜蛋白结合形成完整的逆转录病毒。逆转录酶没有3-5个核酸外切酶活性或校正活性，因此它的错误率比任何DNA聚合酶都高。例如，每2000到4000个由人类免疫缺陷病毒逆转录酶合成的核苷酸中就会有一个不正确的碱基，这在一定程度上解释了人类免疫缺陷病毒1