第五章 紫外-可见吸光光度法.ppt

1、1,第五章,紫外-可见吸光光度法,2,化学分析：常量组分(1%), Er : 0.1%-0.2% 依据化学反应, 使用玻璃仪器,化学分析与仪器分析方法比较,仪器分析：微量组分(1%), Er : 1%-5% 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器,准确度高,灵敏度高,3,仪器分析方法分类,2. 电化学分析法: 依据物质的电化学性质及其变化,3. 色谱法: 气相色谱, 液相色谱,毛细管电泳法 4. 质谱法、热分析法、放射化学法等,4,吸光光度法 基于被测物质的分子 对光 具有选择吸收的特性而建立的分析方法。, 5-1 吸光光度法的基本原理,特点 灵敏度高：测定下限可达10-5-10-6molL

2、-1； 准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差2%-5 操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单 应用广泛,5,一、光的基本性质,波动性,光的传播速度:,c真空中光速 3.0 108 m/s 波长，单位：m,cm,mm,m,nm, 1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1=10-10m,频率，单位：Hz 次/秒,6,h普朗克(Planck)常数 6.62610-34Js E光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 1eV=1.6021019 J,微粒性,光量子，具有能量：,7,结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低. 单色光：具有相同能量

3、(相同波长)的光. 混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在 一起. 例如白光.,波粒二象性,8,光学光谱区,9,二、物质对光的选择性吸收,物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,吸收黄色光,光谱示意,表观现象示意,复合光,10,不同颜色的可见光波长及其互补光,11,价电子相对于原子核的运动-电子能级; 能级差：1-20 ev；吸收波长：1.25-0.06 m； 紫外-可见光谱或电子光谱。 2. 原子核在其平衡位置附近的相对振动-振动能级; 能级差：0.05-1 ev；吸收波长：25-1.25 m； 红外光谱或分子振-转光谱。 3. 分子本身绕其重心的转动-转动能级. 能级差：0.005-

4、0.05 ev；吸收波长：250-25 m； 远红外光谱或分子转动光谱。,物质分子内部3 种运动形式及其对应能级,12,三、定性分析与定量分析的基础,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择吸收,在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。,13, 5-2 光的吸收定律郎伯-比耳定律,郎伯-比耳定律； 吸光度与透光度的关系； 偏离郎伯-比耳定律的原因；,14,一、郎伯-比耳定律,透光度(透射比) Transmittance,透光度定义：,T 取值为 0.0% 100.0%,全部吸收,T = 0.0 %,全部透射,T = 100.0 %,15,朗伯定律:(1760) Ab 当入射光的

5、、吸光物质的c一定时，溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.,比耳定律(1852) Ac 当入射光的、液层厚度b 一定时，溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.,16,意义：当一束平行单色光通过均匀、透明的、非散射的吸光物质时，其吸光度与溶液液层的厚度和浓度的乘积成正比。,A=lg(I0/I)=abc,前提条件： 单色光：应选用max处测定； 吸光质点形式不变； 离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件(酸度、浓度、介质等)； 稀溶液：浓度太大，分子间作用力增强。,17,吸光度与透光度,T ： 透光度,A： 吸光度,T,T = 0.0%,A = ,T = 100.0%,A = 0.0,A = 0

6、.434,T = 36.8%,18,吸光系数,b: 吸光液层的厚度, cm,c: 吸光物质的浓度, g/L, mol/L,a：比例常数,入射光波长,物质的性质,温度,取值与浓度的单位相关,c: mol/L,a ,摩尔吸光系数, cm-1 mol1 L,c: g/L,a,吸光系数, Lg1cm-1,Molar Absorptivity,19,溶液浓度的测定,Abc,工作曲线法 (标准曲线),朗伯-比耳定律的分析应用,吸光度的加和性与吸光度的测量,A = A1 + A2 + +An,20,二、偏离郎伯-比耳定律的原因,主要原因,非单色光,吸光质点的相互作用,21, 5-3 紫外-可见吸光光度计,分

7、光光度计的构成； 分光光度法的灵敏度和准确度,22,23,24,紫外-可见分光光度法, UV-VIS,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,25,吸光分析法的仪器简介,紫外-可见分光光度计组件,光源,单色器,样品池,检测器,显示装置,氢灯, 氘灯, 180-375 nm; 卤钨灯, 320-2500 nm.,基本要求: 光源强, 能量分布均匀, 稳定,作用: 将复合光色散成单色光,棱镜,光栅,玻璃, 350-3200 nm, 石英, 185-4000 nm,光学玻璃, 石英,作用: 将光信号转换为电信号, 并放大,光电池，光电管, 光电倍增管, 光导摄像管(多道分析器),微安表、检流计、屏幕、数

8、字显示记录仪,26,27,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,28,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。,波长范围宽, 色散均匀, 分辨性能好, 使用方便.,29,单光束分光光度计,可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图,30,吸光光度法的灵敏度与准确度,灵敏度,吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，检测限大多可达10-3 10-4 g/L 或 g/mL 数量级。,准确度,能满足微量组分测定的要求。一般相对误差25%。,31,对摩尔系数的理解一, =1.1104,测定,工作曲

9、线的斜率即为摩尔吸收系数,摩尔吸收系数是对吸光物质而言，是由吸光物质的结构特征，吸光面积等因素决定。,灵敏度的表示方法,摩尔吸光系数 ,当 b=1 时，,32,对摩尔系数的理解二,对同一种待测物质，不同的方法具有不同的 ，表明具有不同的灵敏度。,例：分光光度法测铜,铜试剂法测 Cu,426 = 1.28104 Lmol-1cm-1,双硫腙法测 Cu,495 = 1.58105 Lmol-1cm-1,一般情况, 104, : 104 105, 105,低灵敏度,中等灵敏度,高灵敏度,33,影响准确度的因素,仪器测量误差,吸光定律,根据误差传递公式，有,又,得,浓度测量的相对偏差,令,得,T =

10、0.368 = 36.8 %,A = 0.434,时，仪器测量误差最小,34,浓度测量的相对误差与T(或A)的关系,实际工作中，应控制T在1070, A在0.151.0之间 (调c, b, ),35, 5-4 实验条件的选择,测量条件； 分析条件；,36,测量条件的选择,测量波长的选择,无干扰，选择测量,max,有干扰,待测溶液吸光度的选择,控制,A = 0.2 0.8,T = 65% 15%,方法,选择 C,选择 b,1 非单色光影响小,2 灵敏度高,37,用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。,参比溶液,I0,I,

11、参比,样品,38,参比溶液的选择,原则：,扣除非待测组分的吸收,以显色反应为例进行讨论,M + R = M-R,max,试液 显色剂 溶剂 吸光物质 参比液组成,无吸收,无吸收,光学透明,溶剂,基质吸收,无吸收,吸收,不加显色剂的试液,无吸收,吸收,吸收,显色剂,基质吸收,吸收,吸收,吸收,显色剂 + 试液 + 待测组分的掩蔽剂,若欲测 M-R 的吸收,A(样) = A(待测吸光物质) + A(干扰) + A(池),A(参比) = A(干扰) + A(池),39,吸光光度法分析条件的选择,显色反应,有机物质,官能团强吸收,直接测定,UV-VIS,官能团弱吸收,衍生化反应,UV-VIS,无机物质

12、,通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度。,40,显色剂与显色反应,41,显色反应的选择,灵敏度高，一般 104; 选择性好; 显色剂在测定波长处无明显吸收, 对照性好, max 60 nm; 反应生成的有色化合物组成恒定，稳定; 显色条件易于控制，重现性好.,42,酸度的选择,酸度的影响,副反应,M + nR = MRn,OH-,H+,存在型体的变化,RH = R- + H+,1,2,生成不同配比的络合物,例，磺基水杨酸 Fe3+,pH = 2-3,FeR,紫红色,pH = 4-7,FeR2,橙色,pH = 8-10,FeR3,黄色,43,酸度的选择,理论计算,例：邻二氮菲-亚铁反应完全度与pH的关系,cRR=10-4molL-1,44,可得适宜pH范围,实际工作，作 A pH 曲线，寻找适宜 pH 范围。,pH3-8,45,显色剂的用量,M + nR = MRn,定量反应,理论计算,46,c(R),c(R),c(R),实际工作，作 A-CR 曲线，寻找适宜 CR 范围。,47,温度的选择,实际工作，作 A-T 曲线，寻找适宜反应温度。,反应时间的选择,实际工作，作 A-t 曲线，寻找适宜反应时间。,48,测定中的干扰以及消除方法,化学法,49, 5-5 吸光光度法应用示例,单组分的测定； 多组分的测定； 紫外光度法在生物学中的应用；,5