实验三 外植体的选择、处理及消毒

1、实验三 、 外植体的选择、处理及消毒一、 实验目的：1、通过本次实验，能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂。2、使学生能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方和熟练的掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基，熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。二、实验原理1、外植体的选择 外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。

2、为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。 （1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。 （2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植 物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。若在生长

3、末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。（3）选取适宜的大小培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.51.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。（

4、4）外植体来源要丰富为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。（5）外植体要易于消毒在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。一般地上组织比地下组织消毒容易，一年生组织比多年生组织消毒容易，幼嫩组织比老龄和受伤组织消毒容易。2、外植体取材的部位：植物组织培养的材料几乎包括了植物体的各个部位，如茎尖、茎段 （1）茎尖：茎尖不仅生长速度快，繁殖率高，不容易发生变异，而且茎尖培养是获得脱毒苗木的有效途径。因此茎尖是植物组织培养中最常用的外植体。（2）节间部：大部分果树和花卉等植物，新

5、梢的节间部是组织培养的较好材料。新梢节间不仅消毒容易，而且脱分化和再分化能力较强，因此是常用组织培养材料。（3）叶和叶柄：叶片和叶柄取材容易，新出的叶片杂菌较少，操作方便，是植物组织培常用的材料。（4）鳞片：水仙、百合、葱、蒜、风信子等鳞茎类植物常以鳞片为材料。（5）其他：种子、根、块茎、块根、花粉等也可以作为植物组织培养的材料。但是，不同种类的植物以及同种植物不同的器官对诱导条件的反应是不一致的。如百合科植物风信子、虎眼万年青等比较容易形成再生小植株，而郁金香就比较困难。百合鳞茎的鳞片外层比内层的再生能力强，下段比中、上段再生能力强。选取材料时要对所培养植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从

6、中筛选出合适的、最易表达全能性的部位作为为植体。3、外植体的消毒 植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。（1）常用的消毒剂 常用的消毒剂如下表所示。理想的消毒剂应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。常用消毒剂的使用方法及效果消毒剂使用浓度/%消毒时间/min去除的难易消毒效果对植物毒害升汞0.10.2

7、210较难最好剧毒酒精70750.11易好有次氯酸钠2530易很好无漂白精粉饱和溶液530易很好低毒过氧化氢1012515最易好无新洁尔灭0.530易很好很小硝酸银1530较难好低毒山农一号/(mg.L-1)0.453060易好无毒 酒精酒精是最常用的表面消毒剂，以70%75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使 菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，

8、甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。升汞又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。 升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。次氯酸钠次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。其消 毒能力很强，不易残留，对环境无害。但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。漂白粉漂白粉的有效成分是次氯酸钙Ca(ClO)2，消毒效果很好，对环境无害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。过氧化氢也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶

9、片的消毒。 新洁尔灭这是一种广普表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。2）消毒方法茎尖、茎段及叶片等的消毒：消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然 后用自来水冲洗。对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料，可用洗涤剂清洗，必要时用毛刷充分刷洗，硬质材料可用刀刮。消毒时在超净台上操作，先用70%酒精浸泡1030s，以无菌水冲洗23次，然后按材 料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%次氯酸钠浸泡1015min或用0.1%升汞浸510min。消毒时要不断搅动，使植物材料与消毒剂充分地接触。若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴Tween-20，最后用无菌水冲洗35次。果实及种

10、子的消毒：先用自来水冲洗1020min，再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次 氯酸钠浸10min，后用无菌水冲洗23次。种子则先用10%次氯酸钠浸泡2030min，难以消毒的可用0.1%升汞消毒510min。对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡810min。花药的消毒：用于组织培养的花药多未成熟，其外面有花萼、花瓣或颖片保护，处于无菌状态。消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗23次，再在漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗23次。根及底下部器官的消毒：由于这类材料生长于土壤中，表面带菌量大，消毒较为困难。可先用自来水冲洗，软毛刷刷洗，用刀切去损

11、伤及污染严重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸510min或2%次氯酸钠中浸1015min，最后用无菌水冲洗3次。在操作时要根据材料的大小、幼嫩、质地等差异做出判断后，再选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间，切不可生搬硬套。消毒的最佳效果应以最大限度地杀死材料上的微生物，而又对材料的损伤最小为好。4、细胞全能性（cell totipotency) ：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都 具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。5、植物细胞全能性的相对性 1）、植物细胞全能性并不意味着任何细胞都可以产生新的植株 2）、动植物细胞全能型的表现存在明显差异 A、

12、生长点细胞（根尖、茎尖） B、形成层细胞 C、永久失去分生能力的细胞 D、中间类型（表皮细胞、薄壁细胞）6、植物细胞全能性实现的途径：脱分化的再分化分化differentiation： 细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育 中形成各类组织和器官完成整个生活周期。脱分化：离体条件下的细胞、组织、器官经过细胞分裂或者不分裂逐渐失去原有组织的功 能，恢复成分生状态，形成无组织结构的细胞团愈伤组织。脱分化的机理：细胞膜透性改变，细胞核增大，内质网扩大，过氧化物增多，蛋白质和酚类物质的合成活跃，从而完成脱分化。影响再分化的因素;1、损伤 2、培养基中生长素与细胞分裂素的配比3、培养条件

13、 4、细胞的位置 5、外植体的生理状态 6、植物体种类的差异7、 愈伤组织：植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经脱分化等一系列过程，转变为分生细胞，进而转变形成一种能够迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团 。一般低，植物各器官、组织都有被诱发产生愈伤组织的潜在可能性。 8、愈伤组织的诱导 诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。激素类型 激素浓度生长素类（2，4-D, IAA , NAA) 0.0110 mg/L细胞分裂素类（玉米素，6-BA ) 0.110 mg /L9、愈伤组织的形成;愈伤组织从增殖组织细胞中产生，激素改变细胞的新陈代谢

14、状态，从生长静止期到代谢旺盛。1、 从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：起动期 （诱导期）、分裂期和分1、 三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。愈伤组织的形态发生 3、愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分化产生不定芽或根的分生组织甚至是胚状体，继之，由这些有结构的组织而发育成苗或完整小植株。10、愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式主要有三种：1)、先产生芽，后在茎的基部长根；2)先长根，再长芽；3)愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。 11、愈伤组织的生长特点：1、细胞数目和体积的快速增加2、质地差异类型大（圆球形、不规则状、片状、针状）3、生理、生化变

15、化快（具体表现在酚类、单宁变化快）三、实验器材：设备： 烧杯、玻棒、标签纸、吸管、玻璃棒、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、50ml三角瓶、1000ml搪瓷杯、50ml量筒、10ml和5ml吸管MS培养基主要用到的试剂：硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2、4D（2、4二氯苯乙酸）、6苄基腺嘌呤（6BA）、盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水等。蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物、盐酸 （1molL-1）、氢氧化钠 （1molL-1）。试剂：饱和洗衣粉水、无

16、菌水、75%酒精、2%次氯酸钠、MS基本培养基和常用试剂母液实验材料：胡萝卜储藏根、银杏茎段、海棠叶和叶柄等四、脱分化再分化高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)外植体愈伤组织芽根再生植株高生长素(1,2-D)实验步骤1、选定和处理材料：根据自己的设定方案选择合适植物的适合部位作为自己的培养对象。 选定外植体后的具体操作步骤： 外植体的预处理- 消毒- 接种1）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗1030min，主要视植物材料清洁程度而定。 2）.用洗衣粉水等浸洗上述植物材料约35min，再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一

17、步减少污染的处理。 同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。 3）.将接种用具、无菌水等从80烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30min后关掉紫外灯。 4）.操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超 净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。 5）.具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并

18、且加有一定量用50%稀释到2%的次氯酸钠等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5cm），开始计算灭菌时间，最好是530min。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌1030秒。 6）.在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3min；清洗58次。 7）.倒出、

19、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。 逐一取出经上述灭 菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。如有必要，也可再行切分。在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下， 8）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能 带有的微生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地

20、半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于超净工作台的适当位置。 9）在完成了该第一只培养容器的外植体接种操作后，用70%乙醇对超净工作台的台面行擦拭灭菌，再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台台面灭菌，直至全部完成。2、愈伤组织的诱导：1）、准备工作A. 接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；消毒溶液、无菌水、装材料的容器、剪刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。B. 实验材料的准备第一步：材料的修整、刷洗、冲洗。第二步：是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动。2）、植物材料表面的灭菌A、工作人员吸收消毒B、装材料的容器及玻璃棒用酒精进行表面消毒C、将待消毒材料浸入75%酒精中10秒，取出用无菌水冲洗D、倒入消毒液并计时E、到时倒出消毒液F、倒入无菌水清洗后，切块接种到培养基上五、影响植物愈伤组织形成的因素1）、激素：多数情况下，单独使用2，4-D可以成功诱导愈伤组织的发生2）、不同浓度的2，4-D对愈伤组织的诱导率是不同的。一般情况下，2，4-D的浓度过低（低于10-9mg/L）时，愈伤组织生长缓慢；浓度过高（高于10 mg/L）时，就会抑制愈伤组织的生长。3）、光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需光。继代培养一般需光。