抗体药物制备技术研究进展

1、1 绪论以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程药物近年来取得了突破性进展，并成功应用于临床。一方面，随着功能基因组学与蛋白质组学的研究进展，将发现与确定越来越多新的与疾病相关的分子靶点，而与这一发展相适应的、具有高度特异性、针对疾病相关分子靶点的抗体药物将被陆续研制成功；另一方面，抗体药物用于癌症、心脑血管疾病、病毒感染以及类风湿性关节炎等疾病的治疗，受到了广泛关注。2 抗体药物发展的历史200多年前，人们将白喉杆菌培养物上清液中分离到的可溶性毒素注入马体，发现得到的抗血清可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗疾病的例子。1891年，法国人Babes等用采自经狂犬病疫苗免疫的人或犬的全血治疗

2、被疯狼严重咬伤的患者，这是抗狂犬病最早应用的例子1。1975年Kohler及Milstein建立了B淋巴细胞杂交瘤技术。该技术使人们通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体（monoclonal anti-body，Mab），这是产生抗体的重大技术革命。1984年诞生了第一个基因工程抗体人鼠嵌合抗体。然而真正以基因工程操作的方式制备抗体却始于1989年底，英国剑桥的W inter小组与Scrips研究所的Lerner小组的创造性工作，他们利用PCR技术克隆人的全部抗体基因，并重组于原核表达载体中，用标记抗原就可筛选到相应抗体，当时称为组合抗体库技术。20世纪90年代后，这一技术不断发展，

3、陆续出现人源化抗体、单价小分子抗体（Fab、单链抗体、单域抗体等）、多价小分子抗体（双链抗体、三链抗体、微型抗体等）、融合蛋白抗体（免疫抗体、免疫黏连素等）及特殊类型抗体（双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体等）2。近年来，发展的噬菌体抗体库技术及核糖体展示抗体库技术,更易于筛选高亲和力抗体和利用在体外进行的方法对抗体性状进行改造3。3 抗体药物的结构与功能特点31 抗体分子的结构 早在20世纪50年代末期，把电镜的观察结果结合Poler利Nisonoff的研究结果，导致了经典的免疫球蛋白单体的Y型结构模式4。现已得知，抗体分子单体的基本结构是由4条肽链组成的四聚体，包括2条完全相同的重链（he

4、avy chain，H链）及2条重链间以二硫键相连，形成“Y”字形结构。重链由约450个氨基酸（IgG、IgA、IgD）或570个氨基酸（IgM、IgE）组成，轻链由约214个氨基酸组成。完整抗体的分子质量约为150kDa5。根据功能，又可把重轻和轻链分为可变区和恒定区，可变区中的互补决定区与抗体结合抗原的多样性有关；而恒定区的结构与抗体的生物学活性有关6。32 抗体分子的功能特点抗体最基本的生物活性就是特异性识别抗原决定簇。分泌性抗体能激活补体的经典途径和旁路途径，穿过上皮细胞层在黏膜表面对病原体形成一层屏障，通过粒细胞和巨噬细胞的调理诱导吞噬细胞，促进NK细胞和淋巴细胞引起的抗体依赖性细胞

5、介导的细胞毒效应，促进嗜酸粒细胞引起的脱颗粒过程。膜表面免疫球蛋白还具有诱导激活、诱导无反应性、诱导分化、诱导B淋巴细胞凋亡的作用。记忆B细胞的膜表面免疫球蛋白具有识别、降解和将特异性抗原提呈给T细胞高亲和力受体的能力。可变区是抗原结合部位，提供免疫应答的特异性。超抗原与抗体的结合是典型的抗原抗体结合区域以外的相互作用。普通抗原只激活T细胞总数的0.01%，而典型的T细胞超抗原可同时激活T细胞总数的5%至25%7。重链可变区和轻链可变区也参与了超抗原与抗体的结合。恒定区的功能包括激活补体。提供效应细胞的结合位点。作为分类的依据并提供转运位点，不同类或亚类的抗体在生物体中具有不同的稳定性8。33

6、 抗体药物的分类 抗体药物从组成上来讲应分为2类，一类是抗体本身即是药物；而另一类是由抗体本身与治疗药物（如放射性核素,毒素等）结合构成。34 抗体药物的制备基因工程抗体药物的制备主要归因于PCR技术的使用（可以通过一套引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因），以及大肠杆菌表达体系的建立（能成功获得具有抗原结合功能的抗体分子片段）。目前主要应用抗体库技术制备单链抗体，所谓抗体库（antibody library）技术，就是用基因工程技术克隆出全套抗体轻链和重链可变区基因，再重组到特定的原核表达载体，转化入大肠杆菌中表达有功能的抗体分子片段，并通过亲和筛选获得高特异性的抗体可变区基因的技术。利用抗体

7、库技术筛选获得抗体基因，最终可用于构建和制备基因工程抗体药物。常见的抗体库技术有：采用RT-PCR技术和噬菌体表达载体进行抗体可变区基因筛选的噬菌体展示技术（phage display）,将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。完全在体外以核糖体为展示模版进行筛选，呈现大容量功能蛋白的核糖体展示技术（ribosome display），这种方法可以获得较高容量的抗体库，用于scFv的制备。最近发展的mRNA展示技术（mRNA display）也是在体外翻译水平上的呈现技术。在mRNA展示中，嘌呤霉素将RNA与它们所编码蛋白共价相连，

8、以mRNA-蛋白复合物为展示模版进行筛选。初步筛选得到的scFv与从噬菌体抗体库筛选的scFv亲和力相似，它可以得到摩尔级亲和力的抗体，也能进行高通量筛选，有较好的应用前景。此外，利用细胞工程获得的杂交瘤细胞也可以通过RT-PCR、重叠聚合酶链反应（overlapping PCR）和噬菌体展示技术，复筛得到具有成熟亲和力和更高稳定性的scFv基因片段9。4 抗体药物制备技术研究现状41 抗体药物在各研究领域的发展情况4.1.1 人源化抗体人源化抗体的制备技术有一个漫长的发展过程，总结和梳理其技术的历史变迁，有助于我们探讨抗体制备技术的规律，树立人类战胜疾病的信心。 从上世纪80年代起人们尝试利

9、用蛋白质工程技术对现有的鼠源抗体进行人源化的改造。嵌合抗体仍保留着30%左右的鼠源序列，将鼠源抗体的恒定区换成了人源性，可引起不同程度的HAMA反应，需要进一步降低其鼠源性。通过将鼠单抗的CDR区移植到人单抗的骨架区上，进一步降低了鼠单抗的异源性，仅有9%的序列来源于亲本鼠单抗，这种抗体称为改型抗体10。但第一代改型抗体所进行的CDR简单移植会产生亲和力急剧降低，第二代改型抗体引人计算机辅助设计，保留部分鼠源抗体的骨架序列，保证改型抗体的亲和力。改型抗体是在保留抗原抗体结合部位空间结构的基础上，将抗体与抗原结合面上的鼠源骨架序列改为人源序列。4.1.2 单克隆抗体药物单克隆抗体以其同质均一、亲

10、和力高、特异性强，优于多克隆抗体，已被广泛应用于医学、免疫学、生物学等许多研究领域11。在药理学研究领域，各种单抗已作为研究受体结构功能及药物作用机制、药物代谢酶细胞色素P-450的功能、药物导向治疗以及药物的免疫学分析方法的有效工具，扩展和深化了药理学的研究内容，极大地促进了药理学的发展12。最先深入研究的是鼠源单抗，至今在鼠源单抗应用方面取得的成就也很多，应用广泛。然而鼠源单抗在应用于人体方面有许多限制，不能激活人体Fc受体及补体系统；在人体内半衰期短，降低了药物的有效剂量；杂交瘤细胞表达水平低，单抗产生剂量小13特别是诱使人体产生抗鼠单抗免疫反应（HAMA）14。鼠源性单抗在治疗黑色紊瘤

11、、结肠癌、乳癌和卵巢癌患者时，HAMA的发生率高达100%15。上述缺点限制了鼠源单抗在人体疾病治疗中的应用。从20世纪80年代中期开始，研究者利用基因重组技术来改造鼠源抗体，将鼠源单抗IgG的可变区与人IgG的恒定区拼接，形成人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody），借此降低鼠源性Fc段引发的HAMA反应。由于嵌合抗体可变区(约占抗体的30% )为鼠源性,仍可诱发HAMA反应16。在鼠单抗人源化过程中，将鼠单抗的互补决定区（CDR）移植到人单抗骨架上形成改型抗体（reshaping antibody），人源性可达90%以上；或者将抗体表面的氨基酸残基改成人抗体中常见的氨基酸，形成

12、镶面抗体（resuffacing antibody）降低其免疫原性而保留原抗体的特异性17。4.1.3 抗肿瘤抗体药物肿瘤是严重危害人和动物生命健康的一类疾病，攻克肿瘤一直是学者们迫切希望解决的问题。通过对肿瘤发生原因、发病机理等方面的深入研究，目前已拥有一系列治疗肿瘤的技术,如外科手术切除、放疗和化疗等，但这些方法存在治愈率低、药物副作用大等不足，肿瘤治疗仍然是困扰医学界的一大难题。而当前，单抗药物已成为肿瘤治疗的主导趋势之一，单抗药物治疗疾病具有明确的靶向性，作用机制明确，因而具有起效快、疗效好、副作用小等优点。现今批准上市的单抗有很多是用于癌症的治疗，在开发中的单抗也有一大半是针对各类癌

13、症。除了针对表达于肿瘤细胞表面靶抗原的单抗开发策略外，另一种开发思路是抑制肿瘤血管生成的单抗药物。肿瘤生长依赖于新血管的生成，而利用单抗抑制肿瘤血管的形成则可使肿瘤得不到代谢必须的营养而自然死亡，抑制肿瘤细胞的恶性增生和转移 18 。42 抗体药物在医学临床的应用抗体在医学临床上的应用大多在用单抗药物治疗肿瘤方面，也会应用于病毒性感染、传染性疾病、风湿性关节炎、自身免疫系统疾病、心血管疾病和Crohns病等。研究和开发单抗药物的主要目标是预防和治疗肿瘤。常规肿瘤治疗药物在杀死肿瘤细胞的同时也破坏了人体正常细胞，而单抗药物则很好地解决了这一难题。单抗药物能识别肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原，使抗肿瘤

14、药物能够选择性地杀伤肿瘤细胞，药物经由静脉注入人体内，药效分子主要集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又可减少对机体的毒副作用，成为人们期望中的理想药物。事实上，单独应用单抗药物治疗肿瘤并不能达到较高的反应率，例如Rituxan对非霍奇金淋巴瘤病人的II期临床研究表明只有6%的完全反应率和46%的部分反应率19,Herceptin在转移性乳腺癌的III期临床实验中仅有15%的反应率,而新近批准的Erbitux在对晚期大肠癌的治疗中的效果很差。已有临床研究表明，当单抗联合化疗或放疗治疗时，可以观察到较高的抗肿瘤活性。放射免疫治疗（Radioimmunotherapy,RIT）则是一种免疫疗法和放射疗法

15、相结合的治疗手段，它是以能与肿瘤抗原相结合的物质作为靶向载体，偶联放射性核素作为“弹头”的肿瘤治疗药物注入体内与肿瘤细胞相关抗原特异结合所致的肿瘤局部比其他正常组织剂量高，达到对肿瘤杀伤而对正常组织损伤小的一种治疗方法20。43 抗体药物制备技术的局限性尽管单抗药物有明确的靶向性，作用机制明确，疗效好，副作用小等优点，但单抗药物的应用仍存在着二个方面的不足。首先是单抗体本身的问题,单抗药物在治疗疾病时效果不尽人意，需要联合化疗或放疗等来提高其疗效，这表明单抗的药物设计上还有很大的改进空间,需要进一步提高其对人体免疫系统的激活功能。其次，目前的单抗药物均是利用哺乳动物细胞培养表达的，而CHO系统

16、相对于原核表达体系其表达产量低，培养条件苛刻，不能大规模化生产，单抗药物费用昂贵，难以普及21。目前国内的治疗性单抗药物几乎都是进口产品。国内单抗开发技术薄弱，表达体系落后，而且现有有限的资金、技术力量又分散在各大高校和研究所，这使得国内的单抗研究只是处于低水平重复状态，或者仅能做到动物实验阶段，难以形成优势力量开发出具有自主知识产权的单抗产品。5 展望抗体药物的发展方向国家“十一五”期间“863”计划重点项目对抗体药物的支持更是将重点放到了大规模细胞发酵工艺方面，抗体药物制备工艺水平落后这一制约中国抗体药物发展的主要瓶颈将会由点到面地获得突破，抗体药物也将可能成为扭转目前中国生物医药产业颓势

17、的契机和率先走向国际化的代表性药物。目前我国抗体药物产业化处在一个关键时期，国际市场上抗体药物的良好表现使国内的企业抑制不住冲动准备建造几千升，几万升的发酵罐，有的已经在建造当中。在这个问题上我们应充分借鉴国外抗体产业化的经验，从自己开发项目的专利情况、市场预期和企业经济实力出发，客观分析，采取适合自己的产业化模式和规模。抗体药物技术已经成为生命科学发展的前沿成果和生物工程的关键技术。从基础理论和技术依据来讲，这一领域涵盖了分子生物学、细胞生物学、免疫学、病理生理学、药理学等基础学科,以及基因工程、细胞工程、发酵工程技术的有机结合。综合国内外基因工程抗体药物发展现状与趋势，我国抗体领域应当努力

18、把握机遇，扩大抗体储备，加强抗体药物的源头创新，提高抗体中下游关键技术,缩小产业化程度与国际水平的差距。最大程度发掘重组抗体药物的潜力，使其更广泛地应用于相关疾病的预防和治疗。参 考 文 献1 lhira M，Yoshikawa T，Enomodo Y，etal. Rapid diagnosis ofhuman herpesvirus 6 infection by a novel DNA amplification method，loop-mediated isothermal amplificationJ，JClinMicrobiol，2004，42（1）：140-145.2 JM沃克等编，

19、谭天伟等译. 分子生物学与生物技术M. 北京：化学工业出版社, 2003.3 卢圣栋，现代分子生物学实验技术M.北京：中国协和医科大学出版社，1999.4 李进，李胜男，王兵.抗体药物的研究进展J.楚雄师范学院学报，2007，第22卷第3期：41-46.5 董志伟，王淡.抗体工程M.北京：北京医科大学出版社，2002：238-259.6 沈倍奋，陈志南，刘民培.重组抗体M.北京：科学出版社， 2005： 217234.7 陈立慧，宋海峰，刘秀文.治疗性人源化单克隆抗体研究进展J.中国新药杂志，2004，第13卷第7期：590-594.8 Smith G P. Filamenlous fusio

20、n phage：novel expression vectors thatdisplay colonelantigens on the virion surfaceJ.Science，1985，228：13151317.9 马小兵.人天然Fab段噬菌体抗体库的构建及抗gp96抗体的初步筛选D.天津医科大学博士学位论文，2006.10 王尚资.全合成人源抗体库和人源化改型抗体库的构建及筛选D.中国海洋大学博士论文，2004.11 章谷生，容秉培主编.单克隆抗体在医学上的应用M.上海：上海科学技术出版社，1987：218-406.12 杨金娥，袁宗辉. 药物单克隆抗体的制备及在药物分析中应用J.江西农业大学学报，2005，第27卷第2期：305-308. 13 Mike Clark.Antibody humanization: acase of the Emperors new clothJ.(specialissue)ImmunologyToday，2000，1-11.14 Hughes D.Therapeutic antibodiesmake a comebackJ.Drug Discovery Today， 1998，3 （10）：439-442.15 Mclaughlin D. Rituximab： perspectiveon single agent exp