第八章+哺乳动物基因工程.ppt

1、生物工程专业核心课程，基因工程，华东理工大学大学张慧田，基因工程，5，2，3，4，1，6，8，9，基因工程基本概念，基因工程基本原理，基因工程必要的基本条件，基因工程操作过程D高等哺乳动物的基因转移，8哺乳动物基因工程，C高等哺乳动物的载体系统，B高等哺乳动物的受体系统一般使用的高等哺乳动物受体细胞，高等哺乳动物细胞的生长特性，正常哺乳动物细胞具有以下四个茄子生物学特性：锚依赖性：细胞生长分裂，血清依赖性：细胞生长的生长因子，接触抑制：细胞与细胞接触后，生长将被抑制的形态依赖性：细胞称为扁平型，长纤维网状结构，长纤维网状结构。 这种状态称为细胞株形成，此时细胞成为细胞株。高哺乳动物受体细胞的条

2、件，旨在高效表达外源基因的高等哺乳动物受体细胞必须具备以下条件：细胞系特征失去了细胞接触抑制性和锚支依赖性特性，大、遗传稳定性、外源基因多次继承后也不会丢失，器官保存容易，适当的标记便于变形体的筛选和维护，生长快，分裂周期短，生长均匀，易于控制。规模培养，大部分正常的高等哺乳动物细胞同时具备这种条件渡边杏。癌细胞能量，安全功能好，不合成分泌致病物质，不诱发癌症，满足上述前4茄子要求，但缺乏安全功能。，高等哺乳动物受体细胞的遗传标记，营养缺陷型哺乳动物受体细胞，5-磷酸核糖-1-超磷酸(PRPP)，嘧啶核苷酸生物合成途径，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，(HPRT)，(TK)，胸腺嘧啶核苷二次黄嘌呤磷酸

3、核糖转移酶(HPRT)编码基因缺陷的受体细胞包括二次黄嘌呤核苷、氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷(hprt-)、高级哺乳动物受体细胞的遗传标记、哺乳动物受体细胞的一般遗传选择标记、遗传标记、编码产物、选择性药、作用机制、 APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418 APH停用G418，DHFR二氢叶酸还原酶氨甲氨甲氨甲氨甲氨蝶呤DHFR HPH-藻岛素B HPH灭活霉素B，TK-胸腺嘧啶核苷激酶氨甲氨蝶呤TK合成TMP，XGPRT-黄嘌呤受美国FDA保护的基因工程受体细胞(GRAS)，C高等哺乳动物的载体系统，8哺乳动物基因工程，腺病毒DNA，猴子泡沫病毒DNA(SV40)，印犹物种病毒DNA(BKV)，腺病毒感

4、染人类细胞，无致癌性；但是对于啮齿动物，大部分腺病毒成员可能致癌。人类腺病毒DNA，腺病毒基因组DNA，ITR，ITR，E1，E2，E3，E4，IVA2，VA；E1-E4是早期基因，与病毒基因组的克隆及晚期基因的表达调控有关，其中E3是编码晚期基因的调节因子，L1-L5是编码病毒包装蛋白的末期，基因。IVa2和Va都是病毒RNA聚合酶的婴儿编码基因。E3区的缺失不会影响病毒颗粒、成熟、基因组的复制功能，因此，在制作载体时，经常删除牙齿2.2 kb片段，将载体的装载量增加到4 kb以上。(阿尔伯特爱因斯坦，美国电视电视剧)，人类腺病毒DNA，基因重排低外源基因和病毒DNA重组后，可以可靠地克隆几

5、个周期。腺病毒DNA载体的特征，安全性好，不整合人的染色体DNA，不会引起恶性肿瘤。宿主范围是受体细胞是否对分裂期要求严格，使用效果好的外源基因在载体上很容易表现出来。猴多种病毒DNA(SV40) SV40属于犹大种病毒过多种病毒，用VP1、VP2、VP3三种茄子外壳蛋白包装，基因组为5224bp的双链环DNA、SV40的生物学特性，SV40是所有哺乳动物宿主细胞的群体蛋白H2但是感染啮齿动物后，会发生非圆柱体联合，引发癌症。猴子多种病毒DNA(SV40)，SV40的基因组DNA，t/T基因编码病毒小抗原和大，抗原和病毒致癌作用密切的相关，分解SV40牙齿宿主细胞前晚期，状态下每个宿主细胞都含

6、有105个病，毒DNA副本，非常适合效率SV40 DNA-为了尽可能提高SV40的装载量，需要删除一些基因、片段，因此重组后的SV40分子必须形成野生和生殖型病毒共同感染受体细胞，才能形成具有传染性的重组病毒颗粒。、apr、ori、viral gene、GPT、SV40 ori、pv2-。 每个宿主细胞最多有500份拷贝，印犹大种病毒DNA(BKV) BKVORI，BKV Gene，DRE，MMTP，APR，E. Coliori，SV40P，NEOR，编码的病毒核心蛋白和外壳蛋白，用SV40来源的启动子控制Neor标记基因G418筛选了重组。作为牙齿载体，在人细胞株中表达b1-干扰素，单纯疱疹

7、病毒B蛋白，取得了成功。人类牛痘病毒DNA，人类牛痘病毒可以在大型DNA病毒，基因组长185 kb的宿主瘦，细胞质中自主复制。以前，外源基因插入病毒基因组的非必需区域构建，具有人类牛痘病毒生物学特性、重组病毒传染性，一旦传染，外源基因就能在最近的病毒启动子控制下高效表达。威廉莎士比亚，Northern Exposure(美国电视电视剧)，但牛痘病毒基因组由于大小的缘故，在体外重组DNA很困难，所以经常在体内重组。大卫亚设、美国电视电视剧(Northern Exposure)、人的牛痘病毒DNA、目前流行的牛痘病毒表达系统，都是预先构建的重组病毒，基因组中插入了可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编

8、码基因。人类牛痘病毒DNA表达载体的构建，外源基因导入受体细胞之前，使上述重组病毒感染细胞变大，对T7RNA聚合酶进行定量表达，然后导入外源基因和T7启动子，群体质粒，哺乳动物受体细胞。这时外源基因整合到受体细胞染色体DNA中，整合到T7RNA中。人类囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。人类牛痘病毒DNA，利用人类牛痘病毒向量表达外源基因的程序，箱子里有减轻病毒基因序列、牙齿外源基因表达产物分离纯化的负担。但是外源基因表达框进入受体细胞后，通常以多拷贝的形式整合到染色体DNA中，受体细胞基因被禁用，外源基因无法表达。哺乳动物细胞的物理转化方法，将要转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入Ca

9、Cl2溶液混合，DNA被磷酸钙晶体颗粒包围。在牙齿点，细胞膜形成吞咽泡沫，磷酸钙晶体部分溶解膜结构，DNA进入苏菲，体细胞。磷酸钙共沉淀法，将上面准备的颗粒悬浮液滴在细胞培养盘上，37保温4-16小时，扔掉DNA溶液，放入新鲜培养基，继续培养7天后，即可筛选出变形酒。外源DNA中混合少量受体细胞内源性DNA，可以提高转化和效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可以将正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的第一个理解。哺乳动物细胞的物理转换方法，将要转换的DNA溶解在受体细胞悬浮液中，然后在电击转化器、样品桶、两端施加瞬时高压电场，在细胞膜上形成小间隙。此时，电击转化法经常用于对磷酸

10、钙共沉淀法没有效果的细胞类型，如显液中的淋巴细胞等。电击转化法、DNA片段可以直接进入受体细胞，而不产生胞音作用。哺乳动物细胞的物理转换方法将要转换的DNA与天然或人工合成磷脂混合，形成表面、活化剂存在下嵌入水性DNA的脂质体结构。DNA立刻进入细胞质和细胞核。利用牙齿程序将外源基因放入老鼠的淋巴细胞和HeLa，脂质体介导法，牙齿脂质体悬浮液中，可与受体细胞膜融合。、通过哺乳动物细胞的物理转换方法，激素疗法，使雌性老鼠超排，与雄性老鼠交配，杀死雌性，老鼠，并从输卵管中清除受精卵。在性原核中。牙齿程序多用于动物个体的遗传转化过程。要操作每个单细胞，通过显微法、显微镜将纯化的DNA溶液快速注入受精

11、卵中变大的雄性，因此不适合基因的克隆和表达。哺乳动物细胞的物理转化法，血细胞是哺乳动物的红细胞在机械作用，病毒柔道，低渗透环，环境中发生溶血，血红蛋白大量溢出，最终形成只被细胞膜包围的细胞，同时外源DNA也很容易进入。上述外部条件消失后，红细胞膜又能恢复原来的通透性。因此，可以先将外源DNA转移到页岩细胞，然后进行页岩细胞介导，核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大大增加，血红蛋白溢出、血影细胞和受体细胞在适当的条件下融合，接受外源DNA，转移到体细胞。哺乳动物细胞的病毒传播法，以病毒DNA为载体，直接传播外源基因，或与野生型病毒粒子一起传播到特定受体细胞。牙齿方法具有方向性、实验重复性、柔道、进入效率高的优点，但也有目前常用载体宿主范围等缺陷，经常不能传染具有重要经济价值的家禽和家畜细胞等。E利用哺乳动物工程细胞高效表达重组蛋白、8哺乳动物基因工程、哺乳动物细胞外表面白质的基本原理，利用哺乳动物工程细胞高效表达外表面白质的鼠标抗体，利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶顺畅剂，利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶顺畅剂VIII，哺乳动物细胞高效表达外表面白质的基本原理，基因扩增是外源氨甲氨甲