第六章 蛋白质的合成

1、欢 迎,欢 迎,蛋白质的生物合成（翻译）Protein Biosynthesis，Translation,第 六 章,基因表达中的信息流,中心法则（The Central Dogma）,蛋白质生物合成中的三大发现,Paul Zamecnik,核糖体是蛋白质生物合成的场所,Mahlon Hoagland,发现转运RNA（tRNA）,Francis Crick,提出tRNA应接器假说,遗传密码,一. 密码的破译 二. 密码的性质 简并性 摆动性 通用性 偏爱性,一. 遗传密码三联子,mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一个密码，也叫三联子密码。翻译时从起始密码

2、子AUG开始，沿mRNA53的方向连续阅读直到终止密码子，生成一条具有特定序列的多肽链。 mRNA中只有4种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸，若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只能代表4种(41=4)。若以两种核苷酸作为一个密码（二联子），能代表42=16种氨基酸。而假定以3个核苷酸代表一个氨基酸，则可以有43=64种密码，满足了编码20种氨基酸的需要。,Francis Crick等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC四个字母组成遗传信息（核酸）准确无误地翻译成由20种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。实验1: 用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4噬菌体r

3、II位点上的两个基因，使之发生移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。实验2: 研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的RNA片段长1200个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合。,遗传密码子的破译,实验3: 以均聚物为模板指导多肽的合成。 在含有tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决定。 1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推出UUU

4、代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。,体外翻译系统,尼伦伯格(.M.W .Nirenberg),ATP、GTP、AA,体外翻译系统,以poly（G）作模板时,多聚G中的鸟苷酸残基以氢键牢固的彼此结合成三股螺旋,防碍其与核糖体结合,所以用多聚核苷酸的方式无法判断出GGG所编码的氨基酸.,实验4: 以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽，5UGU GUG UGU GUG UGU GUG3,不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。,实验5: 以共聚三

5、核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，可能有3种起读方式：5UUC UUC UUC UUC UUC3或 5UCU UCU UCU UCU UCU3或 5CUU CUU CUU CUU CUU3分别产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）. 多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种多肽：5GUA GUA GUA GUA GUA3或5UAG UAG UAG UAG UAG3或5AGU AGU AGU AGU AGU3由第二种读码方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生GUA（Val）或AGU（Ser）。,氨基酸的“活化”与核糖体结

6、合技术。 如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。 以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。,核苷酸结合技术,AUG,UG

7、A,UAA,UAG,遗传密码的性质,1.连续性(commaless) 2.简并性(degeneracy) 3.通用性(universal) 4.摆动性(wobble) 5.偏爱性(bias),1.连续性(commaless) 编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。,连续性和方向性:两个密码子之间无任何核苷酸加以隔开和重叠，如插入/删除碱基，可发生移码突变或框移,遗传密码的特点,遗传密码的连续性,沿5/-3/方向连续阅读,插入碱基,缺失碱基,移码,突变,5-U-A-C-U-A-C-U-A-C-U-A-C-3,5-U-A-C-U-A-C-U-A-C-U-A-C-3,

8、5-U-A-C-U-A-C-U-A-C-U-A-C-3,2.简并性(degeneracy) 多数氨基酸都具有一个以上的密码子,密码子的这种特性就称为密码子的简并性. 编码相同氨基酸的密码子称为密码子家族(codon family),其成员互称为同义密码子(synonymous codons).,遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。 起始密码子：AUG 终止密码子：UAA, UAG, UGA,密码子的使用频率,简并性的生物学意义？ 可以降低由于遗传密码突变造成的灾难性后果 假如每种氨基酸只有一个密码子，那么剩下的44个密码子都成了终止

9、子，如果一旦哪个氨基酸的密码子发生了单碱基的点突变，那么极有可能造成肽链合成的过早终止。如GUN编码Ala，由于简并性的存在，不论第三位的U变成什么，都仍然编码Ala,3.摆动性(wobble) 转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。,密码子,反密码子,3,3,1 2 3,3 2 1,密码子、反密码子配对的摆动现象,Wobble hypothesis 任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。 反密码子第一位是A或C时，只能识别

10、一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。当Inosine（I）作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。 如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。如UUA和CUU都编码亮氨酸,但它们却有各自的tRNA.,4.通用性(universal) 蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。 密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。,5. 遗传密码的偏爱性,多数氨基酸有一个以上的密码子,但这些密码子的使用频率各不相同,称之为遗传密码的偏爱性. 原核生物和真核生物有各自的密

11、码子偏爱性. 基因工程指导原则,使人工合成的基因片段在细胞内高效表达.,第二节 蛋白质的生物合成,一 生物合成的模板-mRNA 二 合成场所-核糖体 三 蛋白质生物合成的机制 四 蛋白质生物合成的调节,参与蛋白质生物合成的物质,*蛋白质生物合成体系 模板： mRNA 原料：20种编码氨基酸 氨基酸运载体：tRNA 场所：核蛋白体 酶：氨基酰-tRNA合成酶、 转肽酶 蛋白质因子：IF、EF、 RF 能量（ATP、GTP） 无机离子（Mg2+、Mn2+）,从mRNA 5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框（open rea

12、ding frame, ORF）。,AUG,UAA,ORF,一、mRNA是翻译的直接模板,原核生物的多顺反子,真核生物的单顺反子,SD序列,原核生物mRNA的起始密码子AUG上游8-13个核苷酸以外有一段 5-UAAGGAGG-3的保守核苷酸序列,成为SD序列(Shine-Dalgarno Sequence). SD序列是mRNA和核糖体识别,结合的位点.它能够与细菌核糖体小亚基16SrRNA的 3-AUUCCUCC-5保守序列反向互补,从而使核糖体借此判定mRNA的翻译起始位点.,Kozak序列,真核生物的mRNA没有SD序列,核糖体小亚 基识别5端帽子结构,随后移动到起始密码子处. 起始密

13、码子常处于-GCCACCAUGG-序列中,这段保守序列的存在能增加翻译起始的效率,这段序列称为Kozak序列.,核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。它是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000个核糖体，而真核细胞内可达106个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达1012 。核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件。,二、核蛋白体是肽链合成的场所,核糖体的组成 原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗

14、粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。 大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1S21表示，大亚基由33种蛋白质组成，分别用L1L33表示。真核生物细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质。,原核生物,真核生物,70S,80S,30 S核糖体亚基结构包括头（head）、基部（base）、平台（platform）以及缝隙（cleft）等；50 S 核糖体亚基的结构包括中央突（central protuberance）、茎（stalk）、嵴（ridge）以及谷（valley）等。核糖体30S小亚基的平台伸入到50S大亚基

15、的谷中而嵌和在一起。 游离状态和蛋白质合成过程中的核糖体结构有区别，说明核糖体的结构在蛋白质合成过程中有一定的灵活性。,头,基部,缝隙,平台,中央突,茎,谷,脊,核糖体的功能中心是富含RNA的 ，亚基相互作用的主要位点也是由RNA组成，而核糖体蛋白只在一些小的和更外周的位点形成中发挥作用 。 解码位点和肽酰转移酶中心都没有蛋白成分 。现在已经确定，距离肽酰转移酶中心最近的核糖体蛋白没有催化作用，它们的功能主要是维持活性位点的构象。 尽管核糖体的解码和肽酰转移酶中心以RNA为主，核糖体蛋白也发挥着非常重要的作用。没有了蛋白成分，核糖体既不能装配也不会发挥其功能。,现在发现在翻译的各阶段均有rRN

16、A的参与，rRNA的正确结构是蛋白质发挥催化功能所必需的。在翻译起始过程中，rRNA的3端直接与mRNA作用；16S rRNA在A和P位直接与反密码子作用；23S rRNA与肽酰-tRNA的CCA端直接作用；大小亚基的结合可能涉及到16S和23S rRNA间的碱基配对关系。 在翻译的各个阶段，抑制翻译的抗生素几乎都作用于rRNA，说明了rRNA的重要性。,rRNA的分子结构基本上都是由部分双螺旋与部分突环相间排列而成。,16S rRNA二级结构,A位点 需要,与mRNA互补,核糖体的功能 活性中心: 即mRNA结合部位、 结合或接受AA- tRNA部位（A位） 结合或接受肽基tRNA的部位（P

17、位） 空载tRNA脱离核蛋白体前的结合位点（E位） 形成肽键的部位（转肽酶中心） 此外还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。,1三个与tRNA结合的位点： A位：又称受位或氨基酰tRNA结合部位，可与新进入的氨基酰tRNA结合；由大、小亚基成分构成。 P位：又称给位或肽酰基tRNA结合部位，可与延伸中的肽酰基tRNA结合；由大、小亚基成分构成。 E位：又称排出位，空载tRNA脱离核蛋白体前的结合位点；主要由大亚基成分构成。,原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式:,A位：氨基酰位 (aminoacyl site),P位：肽酰位 (peptidyl site),E位：排出位 (exit site

18、),每种氨基酸都有26种相应的tRNA，书写时在右上角注上氨基酸缩写符号，如tRNAPhe代表转运苯丙氨酸的tRNA。tRNA由7090个核苷酸组成，二级结构呈三叶草形 (clover leaf)。双螺旋区构成了叶柄，突环(loop)区好像是三叶草的三片小叶。由于双螺旋结构所占比例甚高，tRNA的二级结构十分稳定。三叶草形结构由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TC环等五部分组成。,三、氨基酸转运工具tRNA,“ L”形三级结构 三叶草型的二级结构可折叠成倒L-型的三维结构。,tRNA的种类 （1）起始tRNA和延伸tRNA能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，

19、其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。 （2）同工tRNA代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA- tRNA合成酶识别。,四. 氨基酰-tRNA合成酶,(aminoacyl-tRNA synthetase),第一步反应,氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E PPi,第二步反应,氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E,氨基酸的活化,E,氨基酸,ATP +,氨酰腺苷酸,E-AMP,PPi,

20、第一步,AMP,第二步,E,氨基酸的活化,3-氨酰-tRNA,氨酰- tRNA合成酶特点,a、专一性： 对氨基酸有极高的专一性，每种氨基酸都有专一的酶，只作用于L-氨基酸，不作用于D-氨基酸。 对tRNA 具有专一性。,b、校对作用：氨酰- tRNA合成酶的水解 部位可以水解错误活化的氨基酸。,五. 蛋白质因子,原核生物起始因子IF (initiation factor)和真核生物起始因子eIF (eukaryotic initiation factor) 延伸因子EF (elogation factor) 释放因子RF (release factor),蛋白质的生物合成过程,翻译过程分为三个

21、阶段 一、翻译的起始 二、翻译的延长 三、翻译的终止 以原核生物为例,一、原核生物的翻译过程,（一） 起始阶段 1.核蛋白体大小亚基分离； 2.mRNA与小亚基结合； 3.起始氨基酰-tRNA与小亚基结合； 4.核蛋白体大亚基结合；,（一）翻译的起始,翻译起始是把带有甲酰甲硫氨酸的起始tRNA连同mRNA结合到核蛋白体上，生成翻译起始复合物（translational initiation complex）,此过程需要多种起始因子的参与。,IF-3,IF-1,1. 核蛋白体大小亚基分离,目 录,IF-1和IF-3与小亚基结合，促进核蛋白体大、 小亚基拆离，为新一轮合成作准备。,IF-3,IF-

22、1,2. mRNA在小亚基定位结合,目 录,原核mRNA的起始部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸顺序组成，称为S-D序列（核蛋白体结合位点，RBS）。而原核16S rRNA存在一段富含嘧啶的序列，二者之间可通过碱基配对，使mRNA与核蛋白体小亚基结合。,IF-3,IF-1,3. 起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到小亚基,目 录,起始 fMet-tRNAimet以及IF2-GTP一起，识别结合小 亚基P位，并对应模板mRNA的起始密码AUG。,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4. 核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成,目 录,IF2结合的GTP被水解，三种I

23、F脱离，50S大亚基与30S小亚基、模板mRNA以及起始fMet-tRNAifMet构成起始复合体。,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,目 录,真核生物翻译起始复合物形成,60S,40S,eIF-2B eIF-3 eIF-6,60S,40S,eIF-3,Met,40S,Met,40S,Met,40S,Met,mRNA,eIF-5,Met-tRNAiMeteIF-2GTP,ATP,ADP+Pi,eIF4E, eIF4G, eIF4B, eIF4A,PABp,各种eIF释放,ADP+Pi,原核、真核生物各种起始因子的生物功能,（二） 延长阶段 肽链延长在核蛋白体上连续性循环式进

24、行，又称为核蛋白体循环，每次循环增加一个氨基酸，包括以下三步： 1.进位(entrance)(注册) 2.成肽(peptide bond formation) 3.转位(translocation),肽链延伸也可被分为三步： 第一步，与新进来的氨基酰-tRNA相结合。氨基酰-tRNA首先必须与GTP-EF-Tu复合物相结合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu复合物并与70S中的A位点相结合。此时，GTP水解并释放GDP-EF-Tu复合物。 第二步，肽键形成。 肽键形成之初，两个氨基酸仍然分别与各自的tRNA相结合，仍然分别位于A位点和P位点上。A位点上的氨基酸（第二个氨基酸）中的-氨基作为亲核基团取代了P位点上的tRNA，并与起始氨基酸中的COOH基团形成肽键。本反应可能由peptidyl transferase 催化。 第三步，移位（translocation）。 核糖体向mRNA的3方向移动一个密码子，使得带有第二个氨基酸（现已成为二肽）的tRNA从A位进入P位，并使第一个tRNA从P位进入E位。此时模板上的第三个密码子正好在A位上。核糖体的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。,肽链合成的延长因子,Tu,T