生物信息学7.ppt

1、生物信息学第七章 蛋白质组分析,毛理凯,2,本课目录,引子 蛋白质结构预测 蛋白质组分析,3,一、引子,4,单个蛋白,涉及的问题 结构预测(2D, 3D) 物理化学性质 功能 空间位置 研究方法 提取 纯化 制作晶体,决定结构 理解机制,功能,5,多个蛋白,涉及的问题 表达过程(DNARNA蛋白,调控网络) 相互作用(yeast two-hybrid,亲和层析) 蛋白家族(family) 检测(2D-PAGE,质谱仪,蛋白质芯片) 研究方法 基因组测序 蛋白预言 计算机分析结构 理解机制,功能,6,一级结构(primary) 氨基酸序列 二级结构(secondary) 螺旋,片层,. 三级(维

2、)结构(tertiary) X光: 80%的蛋白(需高浓度,结晶) 核磁共振(NMR): 磁场,350aa 四级结构(quaternary) 亚基之间特定的空间关系,蛋白的四级结构,7,蛋白结构的主要仓库 PDB,始建于1971 32000个结构数据(其中约3万是蛋白),读取PDB文件的门户网站 Swiss-Prot, NCBI, EMBL,PDB,CATH, Dali, SCOP, FSSP 解释PDB文件的数据库,8,用”PubMed”搜蛋白结构(NCBI),进入”PubMed” 选择”Structure” 输入要找的蛋白名称或ID号等(如RecBCD, E. coli DNA repai

3、r) 点击”Go” 点击感兴趣的结果(1W36,进入MMDB) 结果列表中包含相关蛋白(powered by BLAST)、文献、结构域(domain)、配体(ligand)、3D缩略图、三维查看器,9,在MMDB看搜到蛋白的结构(NCBI),MMDB (Molecular Modeling Database): NCBI的大分子三维结构数据库 Chen, J. 2003 数据来自PDB 打开的单个蛋白的页面中包括 文献、简单描述、入库日期、物种(taxonomy) 该蛋白的PDB, VAST链接(entire chain/View 3D Alignment) 三维查看器(Cn3D) 分子成分

4、(图): chain, 3D domain, classification/family, ligand,10,点击其中的PDB (RCSB)链接,显示,三维结构实验数据 蛋白分类 SCOP链接: 结构域(家族,超家族) CATH链接: 域, Class, Architecture, Topology, Homology GO链接: 功能,过程,细胞组成 更多信息 生化性质,配体,SNP (Sequence Details)图形显示各域的分布,类别,DSSP二级结构,PDP域 更多外部链接(对于RecBCD多达26个),11,更多有用的链接,PDB的外部链接中Compute pI Mw点击Ch

5、ain B (可计算各链分子量) 在打开的Compute pI/Mw页面中点击EX5B_ECOLI (ExPASy,大量信息,链接) 在打开的UniProtKB/Swiss-Prot页面中点击EcoCyc:EG10824-MONOMER (biocyc,参与的反应/路径图),12,二、蛋白质结构预测,13,蛋白结构与人类疾病 (重要性),一些单氨基酸(aa)突变可引起蛋白结构的重大变化 CFTR的F508突变改变螺旋结构,从而改变其功能 另一些变化则不明显 一些蛋白引起的疾病 囊肿性纤维化(cystic fibrosis): CFTR 镰刀性贫血: 血红蛋白 疯牛病: 朊蛋白 阿尔兹海默氏征:

6、 淀粉样前体蛋白,14,二级结构取决于氨基酸侧链结构,由氢键形成 螺旋(helix) 4-40aa,蛋白质二级结构及类型,15,折叠(sheet) 5-10aa 方向: 平行或反平行(C,N端方向一致或相反) 转角(turn) 无规则卷曲(random coil),蛋白质二级结构及类型,16,蛋白二级结构预测算法,Chou和Fasman(1974)的算法(经验参数法) 基于氨基酸出现在螺旋,折叠,转角的频率 经验性方法 例如: proline只出现于转角,不出现于螺旋 相关算法: GOR (Garnier, Osguthorpe, Robson),17,蛋白二级结构预测算法,现代算法 多序列比

7、对, 人工神经网络等 从结构数据库中提取结构形成的规则,建立未知结构蛋白的模型 成功率更高(70-75%) 第三代算法(考虑多条序列) 运用长程信息和蛋白质序列的进化信息 准确度有了比较大的提高,18,蛋白二级结构预测算法,GOR方法 基于信息论和贝叶斯统计学 不仅考虑被预测位置本身氨基酸残基种类的影响,而且考虑相邻残基种类对该位置构象的影响 Lim方法(立体化学方法) 氨基酸的理化性质对二级结构影响较大 如疏水性、极性、侧链基团的大小等,19,蛋白二级结构预测网站,GOR4 “pubmed”得到RecBCD序列(注意删除数字) 输入序列,点击”submit” Jpred NNPREDICT

8、PHD (利用进化信息) Predator PredictProtein PSIPRED SAM-T99sec,20,蛋白三级结构研究方法,实验方法 X光晶体衍射 核磁共振(NMR) 计算方法 从头算方法(ab initio/de novo)/理论分析法 分子动力学 能量最低假设 比较建模(comparative modeling) 基于同源性,21,从头算方法,根据物理化学原理(如原子之间作用力),建立模型,预测结构 一些问题 自然的蛋白质结构和未折叠的蛋白质结构,两者之间的能量差非常小(1kcal/mol数量级) 蛋白质可能的构象空间庞大,针对蛋白质折叠的计算量非常大 计算模型中力场参数的

9、不准确性,22,从头算方法,待测蛋白没有同源性时可用此法 Rosetta Stone法 精度可达6埃以内,23,比较建模/同源模型化方法(统计方法),较可靠 通过同源序列分析或者模式匹配预测蛋白质的空间结构或者结构单元 如: 锌指结构、螺旋-转角-螺旋结构、DNA结合区域等(motif) 原理 许多不同的序列会采用同一个基本的折叠 具有相似序列的蛋白倾向于有相似结构 一对自然进化的蛋白,如果它们的序列具有2530%的等同部分,可以假设它们结构相似,24,比较建模算法,步骤 识别结构保守域 将待测蛋白与模板比对 保留30%同源性的结果 建模 评价模型 一般而言,同源性越高,结构预言越精确 50%

10、同源性,精确度可达1埃,25,比较建模网站,SWISS-MODEL (ExPASy) “pubmed”得到RecBCD序列(注意删除数字) 选择First Approach mode 输入email, title, 序列 等待 Predict Protein server (Columbia) WHAT IF (CMBI, Netherlands),26,三、蛋白质组分析,27,酵母双杂交(yeast two-hybrid/Y2H),研究在活细胞内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用 原理,Reporter gene,Bait protein DNA Binding,Prey protein DNA

11、 activation,express,28,原理(1),29,原理(2),30,优点,高灵敏度: 检测的结果可以是基因表达的积累效应,蛋白质间微弱的、瞬间的作用也能检测到 检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况 作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤,31,酵母双杂交的结果,32,问题,相互作用定位于细胞核内 许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行 假阳性 某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用 某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域,能与其他蛋白形成稳

12、定的复合物,33,改进与发展,减少假阳性 假阳性显示分析法 双筛选系统 哺乳动物双杂交系统 反向酵母双杂交系统(reverse Y2H) 鉴定阻断蛋白间相互作用 酵母三杂交系统(three-binding hybrid) 多一杂合RNA 酵母单杂交 核酸和文库蛋白之间的研究,34,酵母双杂交的新发展和应用,应用 阐明蛋白质相互作用的结构域 绘制蛋白质联系图谱 发现新的蛋白质(prey)和蛋白质的新功能 研究抗原和抗体的相互作用 筛选药物的作用位点,35,蛋白芯片,第一张商品化的抗体芯片(Ab Microarray 380)由美国BD Clontech公司推出 操作流程(一天可完成) 蛋白质提取 用两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品 洗去多余的标记分子 与芯片杂交孵育 扫描分析结果,36,2D-PAGE,蛋白质二维电泳 一维: 等电点 二维: 在变性的环境中,带电,在电场中移动 一次能发现几百至几千个蛋白,37,质谱技术,质谱仪的结构组成 样品入机的离子源 测量被介入离子的分子量的装置 应用 肽质指纹术(peptide mass fingerprint, PMF) 肽片段(peptide fra