食品安全国家标准食品中维生素B12的测定征求意见稿

1、食品安全国家标准食品中维生素b12的测定（征求意见稿）201x-xx-xx实施201x-xx-xx发布中华人民共和国卫生部 发布1.1.1.1 2010-06-01实施2010-发布 前 言本标准代替 gb 5413.14-2010婴幼儿食品和乳品中维生素b12 的测定。本标准与 gb 5413.14-2010相比较，主要变化如下： 增加了液相色谱-串联质谱法； 增加了免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法； 增加了固相萃取-在线柱切换高效液相色谱法。食品安全国家标准食品中维生素b12的测定1 范围本标准规定了液相色谱-串联质谱法、免疫亲和柱层析净化液相色谱法、固相萃取-在线柱切换高效液相色谱法和微

2、生物法测定维生素b12（以下简称vb12）的方法。本标准第一法、第二法适用于配方奶粉、配方米粉和强化vb12的饮料中vb12含量的测定，第三法适用于配方奶粉、配方米粉中vb12含量的测定，第四法适用于天然食品和强化食品中vb12的测定。第一法 液相色谱-串联质谱法2 原理试样用乙酸钠缓冲溶液溶解，加入蛋白酶和淀粉酶在37 下酶解；用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等）转化为较稳定的氰钴胺素。样液通过免疫亲和固相萃取柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离、电喷雾离子源离子化、多反应离子监测（mrm）、同位素稀释内标法定量。3 试剂和溶液注：除非另有规定，所

3、用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1乙酸钠（ch3coona）。3.1.2 氢氧化钠（naoh）。3.1.3 乙酸（ch3cooh）。3.1.4 乙腈（ch3cn，色谱纯）。3.1.5 乙酸铵（ch3coonh4，色谱纯）。3.1.6 氰化钾或氰化钠（kcn/nacn）。 3.1.7 胃蛋白酶（活力，38 u/mg）。3.1.8 taka-淀粉酶（活力，135 u/mg）。3.1.9 氮气（n2，纯度 99.9 %）。3.2 试剂配制3.2.1乙酸钠缓冲液（50 mmol/l）：称取 4.1 g无水乙酸钠，用950 ml水溶解，用乙酸调ph至 4.0 0

4、.1后用水定容至1000 ml。3.2.2 氰化钾（或氰化钠）溶液注1.1（1 mg/ml）：称取 0.1 g 氰化钾（或氰化钠）固体，用水溶解并定容至100 ml。注1.1：nacn 和 kcn 为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行 nacn / kcn 溶液的配制或使用。3.2.3 氢氧化钠水溶液（1 mol/l）：称取4.0 g氢氧化钠用水溶解并定容至100 ml。3.2.4 乙酸铵水溶液（2.5 mmol/l）：称取0.19 g乙酸铵用水溶解并定容至1000 ml。3.2.5 乙腈水溶液（90%，体积比）：分别量取100 ml水、900 ml乙腈混匀，超声脱气。3.3 标准

5、品3.3.1 vb12标准品（c63h88con14o14p，纯度99%）。3.3.2 同位素标准（13c7-vb12）溶液（1 g/ml）。3.4 标准溶液配制3.4.1 标准储备液（1 mg/ml）：用烧杯称取10 mg（精确至0.01 mg） vb12标准品，用水溶解后，移至10 ml容量瓶中，定容至刻度。溶液转移至试剂瓶后，在4 下避光保存，备用。3.4.2 标准工作液（100 ng/ml）：准确吸取10 l标准储备液定容至100 ml，在4 下避光保存。3.4.3 同位素内标工作液：取vb12同位素内标溶液0.5 ml（1 g/ml），用水稀释至10 ml，此溶液浓度为50 ng /

6、ml。在4 下避光保存。3.4.4 标准系列工作溶液：分别准确移取标准工作液5 l、10 l、20 l、50 l、80 l、100 l、200 l，并同时分别加入20 l同位素内标溶液（3.4.3）用水定容至1 ml。其浓度分别为：0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、8 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml，同位素内标浓度为1 ng/ml。此标准系列溶液使用前配制。4 仪器和设备4.1 天平：感量0.01 g、0.001 g和0.00001 g。4.2 ph 计：精度0.01。4.3 水浴锅：温度范围25 100 。4.4 超声波清洗器。4.5 离心机

7、：转速 10000转/分钟 (带50 ml离心管)。4.6 固相萃取装置。4.7 免疫亲和柱。4.8 一次性注射器（规格30 ml或50 ml）。4.9 真空泵。4.10 氮吹仪。4.11 一次性微孔滤头：带0.22 m微孔滤膜。4.12 液相色谱-质谱联用仪：带电喷雾离子源。4.13 液相色谱柱：ods c18柱（柱长50 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径1.7 m），或相当者。5 分析步骤5.1 样品提取5.1.1 乳粉、米粉在150 ml锥形瓶中准确称取试样5 10 g（准确到0.01 g），依次加入20 l 同位素内标溶液（3.4.3）、50 ml乙酸钠缓冲液（3.2.1）、2 g胃

8、蛋白酶、0.5 g taka-淀粉酶，充分混合使样品充分溶解，37 水浴30 min后加入2 ml氰化钾（或氰化钠）溶液注1.1，转入100 水浴中，保持60 min，冷却至室温。将样品溶液移至100 ml容量瓶中，用乙酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀后10000 转/分钟下离心10 min，吸取上清液50 ml待用。5.1.2 饮料碳酸饮料（汽水）类：准确称取40 g(准确到0.01 g)，于超声波振荡器中脱气10 min，加入20 l 同位素内标溶液（3.4.3）、用氢氧化钠溶液（3.2.3）调ph值至7.00.1，用水定容至50 ml,备用。果汁和蔬菜汁类：试样均质后，准确称取40g（精精确到

9、0.01 g），加入20 l 同位素内标溶液、用氢氧化钠溶液调ph值至7.00.1，用水定容至50 ml,在10000 转/分钟下离心5 min，备用。5.2 净化5.2.1 免疫亲和柱的准备将注射器筒与免疫亲和柱的顶部相连（用柱连接器），再将固相萃取装置与循环水式真空泵连接。5.2.2 净化放弃免疫亲和柱内的缓冲液后，取20 ml上述样液（以试样中约含vb12 10 20 ng）移至注射器筒中，调节下滴速度，以2 3 ml/min的速度下滴。待样液完全过柱后，再往注射器筒内加入10 ml水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱后，用真空泵抽干，取下注射器筒。脱离真空系统，在免疫亲和柱下部放置10 ml玻

10、璃试管，分三次各加入3 ml甲醇洗脱免疫亲和柱，收集全部洗脱液注1.2。在60 70 下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用乙酸铵水溶液（3.2.4）定容至1.0 ml，涡旋30 s溶解残留物，微孔滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中待测。注1.2：1,使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照说明书要求进行操作；2,全自动（在线）或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。5.3 液相色谱参考条件流动相：a相，乙酸铵水溶液（3.2.4）；b相，乙腈水溶液（3.2.5）。流速：0.4 ml/min。梯度洗脱：参见附录a中的a.1。色谱柱温度：40 。进样体积：

11、10 l。5.4 质谱参考条件检测方式：多离子反应监测（mrm）。离子源控制条件：见附录a.2。离子选择参数：见附录a.2。液相色谱-质谱图和子离子扫描图见附录a.3。5.5 定性试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在2.5之内。待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（s/n3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（s/n10）。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表1规定的范围。

12、表1 定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20% 50%10% 20%10%允许相对偏差20%25%30%50%各检测目标化合物以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的lc-ms/ms色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20%），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应lc-ms/ms色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。5.6 空白试验不称取试样，按5.1和5.2的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。6 分析结果的表述6.1 标准曲线绘制 将标准系列溶液由低

13、到高浓度依次进样检测，以相对峰面积-浓度作图，得到相应的标准曲线回归方程。6.2 计算按式（1）计算vb12的含量。（1）式中：x 样品中待测组分的含量，单位为微克每千克（g/kg）。c 标准溶液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）。ci 测定液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）。a 测定液中待测组分的峰面积。asi 标准溶液中内标物质的峰面积。v 定容体积，单位为毫升（ml）。csi 标准溶液中内标物质的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）。ai 测定液中内标物质的峰面积。as 标准溶液中待测组分的峰面积。m 样品称样量，单位为克（g）。计算结果保留两位有效数字。7

14、 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %（或者以其他技术指标表示）。8 其他本方法配方奶粉的检出限是0.17 g/kg，定量限是0.5 g/kg；配方米粉的检出限是0.35 g/kg，定量限是1.0 g/kg；饮料的检出限是0.17 g/kg，定量限是0.5 g/kg。第二法 免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法9 原理试样用乙酸钠缓冲溶液溶解，加入蛋白酶和淀粉酶在37 下酶解；用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等）转化为较稳定的氰钴胺素。样液通过免疫亲和固相萃取柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，紫外检测器检

15、测。外标法定量。10 试剂和溶液注：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 gb/t 6682规定的一级水。10.1 试剂10.1.1 无水乙酸钠（ch3coona）。10.1.2 氢氧化钠（naoh）。10.1.3 乙酸（ch3cooh）。10.1.4 甲醇（ch3oh，色谱纯）。10.1.5 乙腈（ch3cn，色谱纯）。10.1.6 三氟乙酸（cf3cooh，色谱纯）。10.1.7 氰化钾或氰化钠（kcn / nacn）。10.1.8 胃蛋白酶（活力，38 u/mg）。10.1.9 taka-淀粉酶（活力，135 u/mg）。10.2 试剂配制10.2.1 乙酸钠缓冲液（50 mmol/l

16、）：称取 4.1 g无水乙酸钠，用950 ml水溶解并用乙酸调ph值至 4.00.1后用水定容至1000 ml。10.2.2 氰化钾（或氰化钠）溶液注2.（1 mg/ml）1：称取 0.1 g 氰化钾（或氰化钠）固体），用水溶解并定容至100 ml。注2.1：nacn 和 kcn 为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行 nacn / kcn 溶液的配制或使用。10.2.3 氢氧化钠水溶液（1 mol/l）：称取4.0 g氢氧化钠固体用水溶解并定容至100 ml。10.2.4 三氟乙酸水溶液（0.04%。体积比）：量取500 ml水，加入200 l三氟乙酸。10.3 标准品vb12标准

17、品（c63h88con14o14p，纯度 99%）。10.4 标准溶液配制10.4.1 标准储备液（1 mg/ml）：用烧杯称取10 mg（准确至0.01 mg） vb12标准品，用水溶解后，移至10 ml容量瓶中，至容至刻度。溶液转移至试剂瓶后，在4 下避光保存，备用。10.4.2 标准工作液（ng/ml）：准确吸取100 l标准储备液定容至100 ml，在4 下避光保存。10.4.3 标准系列工作溶液：准确移取标准工作液 50 l、80 l、100 l、150 l、200 l，用水定容至1 ml。其浓度分别为：50 ng/ml、80 ng/ml、100 ng/ml、150 ng/ml、20

18、0 ng/ml，此标准系列溶液临用前配置。11 仪器和设备11.1 天平：感量0.01 g、0.001 g和0.00001 g。11.2 ph 计：精度0.01。11.3 水浴锅：温度范围25 100 。11.4 超声波清洗器。11.5 离心机：转速 10000 转/分钟(带50 ml离心管)。11.6 固相萃取装置。11.7 免疫亲和柱。11.8 一次性注射器（规格30 ml或50 ml，使用注射器筒部分）。11.9 循环水式真空泵。11.10 氮吹仪。11.11 一次性微孔滤头：带0.22 m微孔滤膜。11.12 液相色谱仪：带紫外检测器和100l进样环。11.13 液相色谱柱：ods c

19、18柱（柱长150 mm，柱内径3.0 mm，填料粒径2.5 m），或相当者。12 分析步骤12.1 样品提取12.1.1 乳粉、米粉在150 ml锥形瓶中准确称取试样5 10 g（准确到0.01 g），依次加入50 ml的乙酸钠缓冲液(10.2.1)、2 g胃蛋白酶(10.1.8)、0.5 g taka-淀粉酶(10.1.9)，充分混合并使样品充分溶解，37 水浴30 min后加入2 ml氰化钾（或氰化钠）溶液注2.2，100 水浴60 min，冷却至室温。将样品溶液移至100 ml容量瓶中，用乙酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀后取约60 ml在10000 转/分钟下离心10 min，吸取上清液5

20、0 ml待用。注2.2：nacn 和 kcn 为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行 nacn / kcn 溶液的配制。12.1.2 饮料碳酸饮料（汽水）类：准确称取40 g(准确至0.01 g)，于超声波振荡器中脱气10 min，用氢氧化钠溶液（10.2.3）调ph值至7.0 0.1，用水定容至50 ml,备用。果汁和蔬菜汁类：试样经均质后，准确称取40 g(精确至0.01 g)，用氢氧化钠溶液（10.2.3）调ph值至7.0 0.1，用水定容至50 ml,在10000 转/分钟下离心10 min，备用。12.2 净化12.2.1 免疫亲和柱的准备将注射器筒与免疫亲和柱的顶部相连（

21、用柱连接器），再将固相萃取装置与循环水式真空泵连接。12.2.2 净化放弃免疫亲和柱内的缓冲液后，取40 ml上述样液（以试样中约含vb12 50 200 ng）移至注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以2 3 ml/min的速度下滴。待样液完全过柱后，再往注射器筒内加入10 ml水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱后，用真空泵抽干。取下注射器筒，脱离真空系统，在免疫亲和柱下部放置10 ml玻璃试管，分三次各加入3 ml甲醇洗脱免疫亲和柱，收集全部洗脱液注1.2。在60 70 下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用三氟乙酸水溶液（10.2.4）定容至1.0 ml，涡旋30 s溶解残留物，微孔滤膜过滤，收集滤

22、液于进样瓶中待测。注2.3：1. 使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照说明书要求进行操作;2. 全自动（在线）或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。12.3 液相色谱参考条件流动相：a相，三氟乙酸水溶液（10.2.4）；b相，乙腈。梯度洗脱：参见附录b中的b.1。流速：0.8 ml/min。色谱柱柱温：35 。进样体积：100 l。检测波长：550 nm。液相色谱图见附录b.2。12.4 测定12.4.1 定量测定待测样液中的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应重新按12.1和12.2进行处理后再进样分析。12.4.2 空白

23、试验不称取试样，按12.1和12.2的步骤做空白实验。确认不含有干扰待测组分的物质。13 计算结果 13.1 标准曲线绘制 将标准系列溶液由低到高浓度依次进样检测，以相对峰面积-浓度作图，得到相应的标准曲线回归方程。13.2 计算按式（2）计算vb12的含量。（2）式中：x试样中vb12的含量，单位为微克每千克，g/kg；a根据试样中vb12的色谱峰的峰面积计算所得的浓度，单位为纳克每毫升，ng/ml；v样品洗脱液的最终定容体积，单位毫升，ml；f样液稀释因子；m试样的称样量，单位克，g；计算结果保留两位有效数字。14 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1

24、0 %（或者以其他技术指标表示）。15 其他本方法配方奶粉的的检出限是0.9 g/kg，定量限是2.5 g/kg；配方米粉的的检出限是1.7 g/kg，定量限是5.0 g/kg；饮料的的检出限是0.9 g/kg，定量限是2.5 g/kg。第三法 固相萃取-在线柱切换高效液相色谱法16 原理试样经酶解、用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等）转化为较稳定的氰钴胺素、固相萃取柱净化，经凝胶色谱柱（一维色谱）进一步分离净化，用在线流分切换法将vb12切换至反相色谱柱（二维色谱）中分离，在550 nm波长进行检测，外标法定量。17 试剂和溶液注：除非另有说明，

25、所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。17.1 试剂17.1.1 乙腈（ch3cn，色谱纯）。17.1.2 甲醇（ch3oh，色谱纯）。17.1.3 甲酸（hcooh，色谱纯）。17.1.4 乙酸（ch3cooh，色谱纯）。17.1.5 三乙胺（c6h15n，色谱纯）。17.1.6 乙酸钠（ch3coona）。17.1.7 氢氧化钠（naoh）。17.1.8 taka-淀粉酶（活力，135 u/mg）17.1.9 氰化钾或氰化钠（kcn / nacn）。17.2 试剂配制17.2.1 乙酸钠缓冲液（0.1 mol/l）：称取 8.2 g无水乙酸钠，用950 ml水溶解并用乙酸

26、调ph至 4.0 0.1 后用水定容至1000 ml。17.2.2氰化钾（或氰化钠）溶液注3.1(1 mg/ml)：称取 0.1 g 氰化钾（或氰化钠）固体，用水溶解并定容至100 ml。注3.1：nacn 和 kcn 为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行 nacn / kcn 溶液的配制或使用。17.2.3 氢氧化钠水溶液(1 mol/l)：称取4.0 g氢氧化钠固体用水溶解并定容至100 ml。17.2.4 淀粉酶水溶液（60 mg/ml）：称取 0.6 g taka-淀粉酶，用水溶解并定容至10 ml。17.2.5 乙腈水溶液（7.5%，体积比）：准确量取75 ml乙腈，用水

27、溶解并定容至1000 ml。17.2.6 乙腈水溶液（含0.4%三乙胺，ph=6.0 0.1，75%，体积比）：准确量取250 ml水、400 l三乙胺，用700 ml乙腈溶解并用甲酸调ph至 6.0 0.1后用乙腈定容至1000 ml。17.2.7 三乙胺水溶液（0.4%，体积比）：准确量取400 l三乙胺，用950 ml水溶解并用甲酸调ph至6.0 0.1后用水定容至1000 ml，此溶液体积分数为。17.3 标准品vb12标准品（c63h88con14o14p，纯度 99%）。17.4 标准溶液配制17.4.1 标准储备液（1 mg/ml）：用烧杯称取10 mg（精确至0.01 mg）

28、vb12标准品，用水溶解后，移至10 ml容量瓶中，至容至刻度。溶液转移至试剂瓶后，在4 下避光保存，备用。17.4.2 标准工作液（1000 ng/ml）：准确吸取100 l标准储备液定容至100 ml，在4 下避光保存。17.4.3 标准系列工作溶液：准确移取标准工作液20 l、60 l、120 l、250 l、400 l，用水定容至10 ml。其浓度分别为：2 ng/ml、6 ng/ml、12 ng/ml、25 ng/ml、40 ng/ml，此标准系列溶液现配现用。18 仪器和设备18.1 天平：感量0.01 g、0.001 g和0.00001 g。18.2 ph 计：精度0.01。18

29、.3 水浴锅：温度范围25 100 。18.4 超声波清洗器。18.5 离心机：转速 10000 转/分钟(带50 ml离心管)。18.6 固相萃取装置。18.7 固相萃取小柱（以下简称spe）60 mg，hlb 或相当者。18.8 一次性注射器（规格30 ml或50 ml，使用注射器筒部分）。18.9 循环水式真空泵。18.10 电热恒温鼓风干燥箱。18.11 氮吹仪。18.12 一次性微孔滤头：带0.22 m微孔滤膜。18.13 二维液相色谱仪：带两个独立的色谱溶剂输送系统（一维色谱为等度泵，二维色谱为梯度泵），六通阀（仪器流路状态示意图参见附录c中的c.1），2 ml进样环，紫外检测器。

30、18.14 液相色谱富集净化柱（一维色谱）：凝胶柱（柱长250 mm，柱内径9.4 mm，填料粒径4 m），或相当者。18.15 液相色谱分析柱（二维色谱）：c18柱（柱长50 mm，柱内径4.6 mm，填料粒径3.5 m），或相当者。19 分析步骤19.1 样品提取在150 ml锥形瓶中准确称取试样5 g（精确至0.01 g），加入25 ml水并涡旋至充分溶解（含淀粉样品加入0.25 ml淀粉酶溶液（17.2.4）充分混匀，37 酶解35 min。），然后依次加入约30 ml乙酸钠缓冲液（17.2.1）、1 ml氰化钾（或氰化钠）溶液注3.2（17.2.2），充分混匀。将试样溶液置于105

31、电热恒温鼓风干燥箱加热60 min（温度达到105 后开始计时），取出试样溶液后用冰水浴迅速冷却至室温。移至100 ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后，转移至离心管，10000 转/分钟离心10 min，取上清液50 ml待用。注3.2：nacn 和 kcn 为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行 nacn / kcn 溶液的配制。19.2 spe净化注3.319.2.1 活化：将注射器筒与spe的顶部相连（用柱连接器），用5 ml甲醇活化spe，再用5 ml的水分2次过柱平衡，保持spe柱填料湿润状态。19.2.2 上样：取40 ml试样移至注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以2

32、3 ml/min的速度下滴。19.2.3 淋洗：待样液完全过spe后，加入5 ml水，继续保持2 3 ml/min的速度下滴，直至淋洗完毕。19.2.4 洗脱：用真空泵抽干spe，取下注射器筒后，脱离真空系统，放入10 ml玻璃试管，分三次各加入3 ml甲醇洗脱，流速控制在每秒1滴，收集全部洗脱液。将洗脱液在60 70 下用氮气缓缓地吹至近干，用1 ml甲醇溶解残留物，涡旋30 s，转移至10 ml容量瓶中，用7.5%乙腈水溶液（17.2.5）定容至刻度，微孔滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中待测。注3.3：全自动（在线）或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。19.3 液相色谱参考条件

33、19.3.1 一维色谱（等度泵）色谱参考条件色谱柱：凝胶柱，7.8250 mm，4 m，或相当者。流动相：7.5%乙腈水溶液（17.2.5）。流速：1.0 ml/min。色谱柱柱温：40 ；进样体积：2 ml；六通阀切换控制时间：0.00 13.6 min: 阀状态1；13.6 16.2 min: 阀状态2；16.2 30.0 min: 阀状态1。19.3.2 二维色谱（梯度泵）色谱参考条件色谱柱：c18柱，4.650 mm，3.5 m流动相：a相，三乙胺水溶液（17.2.7）；b相，乙腈水溶液（17.2.6）流速：1.0 ml/min。检测波长：550 nm。梯度洗脱：参见附录c中的c.2；

34、液相色谱图见附录c.3。19.4 测定19.4.1 标准曲线绘制 将系列标准溶液由低到高浓度依次进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。19.4.2 定量测定待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应重新按19.1和19.2进行处理并适当稀释后再进样分析。19.4.3 空白试验不称取试样，按19.1和19.2的步骤做空白实验。确认不含有干扰待测组分的物质。20 结果计算按式（3）计算vb12的含量。（3）式中：x试样中vb12的含量，单位为微克每千克，g/kg；a根据试样中vb12的色谱峰与对应内标色谱峰的峰面积关系，经计算所得的浓度，单位为纳克每毫升，ng/ml；

35、v样品洗脱液的最终定容体积，单位毫升，ml；f样液稀释因子；m试样的称样量，单位克，g；计算结果保留两位有效数字。21 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %（或者以其他技术指标表示）。22 其他本方法配方奶粉的的检出限是0.9 g/kg，定量限是2.5 g/kg；配方米粉的的检出限是1.7 g/kg，定量限是5.0 g/kg。第四法 微生物法23 原理利用莱士曼氏乳酸杆菌（lactobacillus leichmannii）对vb12 的特异性和灵敏性，定量测定出试样中vb12 的含量注4.1。在测定用培养基中供给除vb12以外的所有营养成分，这样微

36、生物生长产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中vb12的含量相对应。以不同浓度标准溶液的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中vb12的含量。 注4.1：可使用商品化的被预先包埋了菌种的微生物法vb12试剂盒，按试剂盒中的操作指南进行操作，其检测原理一致，检测效果相当。24 试剂和材料注：除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯；水为gb/t 6682 规定的二级水，使用前应进行灭菌处理。24.1 菌株：莱士曼氏乳酸杆菌（lactobacillus leichmannii）atcc 7830。24.2 vb12标准品（ c63h88con14o1

37、4p，纯度99%）。24.3 培养基24.3.1 乳酸杆菌琼脂培养基：见附录d。24.3.2 乳酸杆菌肉汤培养基：见附录d。24.3.3 vb12 测定用培养基：见附录d。24.4 氯化钠溶液（9 g/l生理盐水）：称取9.0 g 氯化钠溶解于1000 ml 水中，分装于具塞试管，每管10 ml。121 灭菌15 min。24.5 乙醇溶液：体积分数为25 %。24.6 无水磷酸氢二钠（na2hpo4）。24.7 无水偏重亚硫酸钠（na2s2o5）。24.8 柠檬酸（含一个结晶水）（c6h8o7.h2o）。24.9 氰化钠或氰化钾（nacn / kcn）。24.10 nacn（或kcn）溶液（

38、10 mg/ml注4.2）：在10 ml棕色容量瓶中称取 100 mg nacn（或kcn），用水溶解并定容至刻度。注4.2：nacn 和 kcn 为剧毒化学注4.3品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行 nacn / kcn 溶液的配制。24.11 标准溶液的制备注4.324.11.1 标准贮备液（10 g /ml）：用烧杯称取10 mg（精确至0.01 mg） vb12标准品，用乙醇溶液溶解并定容至1 l。24.11.2 标准中间液（100 ng/ml）：用乙醇溶液将5.0 ml 标准贮备液定容至500 m。24.11.3 标准工作液（1 ng/ml）：用乙醇溶液将5.0 ml 标准中间液

39、定容至500 ml。24.11.4 标准曲线工作液：分别吸取两个5 ml 标准工作液于250 ml 和500 ml 容量瓶中，用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为0.02 ng/ml；低浓度溶液的浓度为0.01 ng/ml。注4.3：1.所有标准溶液要储存于冰箱内。24.11.1、24.11.2 和24.11.3 保存期三个月，24.11.4 临使用前配制；2.若使用预先包埋了菌种的微生物法vb12试剂盒，请使用试剂盒所提供标准液，按试剂盒中的操作指南进行稀释。25 仪器和设备注：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：25.1天平：感量为0.1 mg。25.2 ph 计：精度

40、0.01。25.3 分光光度计。25.4 涡旋混合器。25.5 离心机：转速 2000 转/分钟。25.6 恒温培养箱：36 1 。25.7 冰箱：2 5 。25.8 无菌吸管：10 ml（具0.1 ml 刻度）或微量移液器和吸头。25.9 瓶口分液器：0 10 ml。25.10 锥形瓶：200 ml。25.11 容量瓶（a 类）：100 ml，250 ml，500 ml。25.12 单刻度移液管（a 类）：容量5 ml。25.13 漏斗：直径90 mm。25.14 定量滤纸：直径90 mm。25.15 试管：18 mm180 mm。注4.4.：准备玻璃仪器时，使用活性剂对硬质玻璃测定管及其他

41、必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后要求在200 干热2 h。26 分析步骤26.1测试菌液的制备26.1.1 将莱士曼氏乳酸杆菌（atcc 7830）的冻干菌株活化后，接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，36 1 培养24 h。再转种2 3 代来增强活力。置2 5 冰箱保存备用。每15天 转种一次。26.1.2 将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，36 1 培养18 24 h，以2000 r/min离心2 3 min，弃去上清液，加入10 ml 生理盐水，混匀，再离心2 3 min，弃去上清液，再加入10 ml 生理盐水，混匀。如前离心操作，弃去上清液。再加10 ml 生理盐水，混匀。吸适量该菌悬

42、液于10 ml 生理盐水中，混匀制成测试菌液。26.1.3 用分光光度计，以生理盐水做空白，于550 nm 波长下测测试菌液的透光率，使其透光率在60 80%之间。26.2 试样的处理26.2.1 称取无水磷酸氢二钠1.3 g，无水偏重亚硫酸钠1.0 g，柠檬酸（含一个结晶水）1.2 g，用100 ml 水溶解。26.2.2 试样处理注4.526.2.2.1强化食品称一定量的样品 (精确到0.0001 g)，试样中含vb12 约50 100 ng，用10 ml 的上述溶液混合后，再加150 ml 水，于121 水解10 min，冷却后调ph 至4.5 0.2，再用水定容至250 ml，过滤。移

43、取滤液5 ml，加入水20 30 ml，调ph 至6.8 0.2，用水定容至100 ml。最终溶液中vb12 的质量浓度约在0.01 0.02 ng/ml，偏重亚硫酸钠的质量浓度小于0.03 mg/ml。26.2.2.2 天然食品称一定量的样品 (精确到0.0001 g)，试样中含vb12 约50 100 ng，用10 ml 的上述溶液混合后，再加 500 l的nacn（或kcn）溶液150 ml 水，调ph 至4.5 0.2后，加入300 mg 的高峰淀粉酶，摇匀，37 c（98.6 f）暗处孵育1 h（其间不时振荡），于121 水解20 min，冷却至室温，再用水定容至250 ml，过滤。

44、移取滤液5 ml，加入水20 30 ml，调ph 至6.8 0.2，用水定容至100 ml。最终溶液中vb12 的质量浓度约在0.01 0.02 ng/ml，偏重亚硫酸钠的质量浓度小于0.03 mg/ml。注4.5：1.nacn 和 kcn 为剧毒化学品；须在通风橱内进行 nacn / kcn 的样品提取；2.按照国家或地区的规定妥善处理 nacn / kcn，及其溶液；3.提取液有可能刺激粘膜、眼睛和皮肤；4.实验后须按照规章净化处理检测仪器（如提取过程中所使用过的容器，高压蒸汽灭菌锅等）。26.3 标准曲线的制作按表2顺序加入水、标准曲线工作液和vb12 测定用培养基于培养管中，一式三份。

45、表2标准曲线的制作试管号s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10水（ml）55432102100.01 ng/ml标准曲线工作液（ml）00123450000.02 ng/ml标准曲线工作液（ml）0000000345培养基（ml）555555555526.4 待测液的制作按表2 顺序加水、样品溶液和vb12 测定用培养基于培养管内，一式三份。表3 待测液的制作试管号1234水（ml）4321待测液（ml）1234培养基（ml）555526.5 灭菌将26.3和26.4 中所有的试管盖上试管帽，121 灭菌5 min（商品培养基按标签说明进行灭菌）。26.6 接种将上述试管迅速冷却至30 以

46、下。用滴管或移液器向上述试管中各滴加1 滴（约50 l）测试菌液（其中标准曲线管中空白s1 除外）。26.7 培养将试管放入恒温培养箱内，36 1 培养19 20 h。26.8 测定注：培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种试管内培养液应是澄清的，如果出现浑浊，则测定无效。26.8.1 以接种空白管做对照，测定最高浓度标准曲线试管的透光率，2 h 后重新测定。两次结果透光率差值若小于2%，则取出全部检验管测其透光率注4.7。26.8.2 用未接种空白试管（s1）作空白，将分光光度计透光率调到100%（或吸光度为0），读出接种空白试管（s2）的读数。再以接种空白试管（s2）为空白，调节透光率

47、为100%（或吸光度为0），依次读出其他每支试管的透光率（或吸光度）。26.8.3 用涡旋混合器充分混合每一支试管（也可以加一滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长为550 nm或630 nm，待读数稳定30 s 后，读出透光率，每支试管稳定时间要相同。以vb12 标准品的含量为横坐标，透光率为纵坐标作标准曲线。26.8.4 根据待测液的透光率，从标准曲线中查得该待测液中vb12 的浓度，再根据稀释因子和称样量计算出试样中vb12 的含量。透光率超出标准曲线管s3 s10 范围的试样管要舍去。26.8.5 对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率计算每毫升该编号待测液vb12

48、 的浓度，并计算该编号待测液的vb12 浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的 15%，超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的四个编号的待测液的总管数的2/3，用于计算试样含量的数据是不充分的, 需要重新检验。如果符合要求的管数超过原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液中vb12 含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为cx。用于计算试样中的vb12 含量。注4.7：绘制标准曲线，既可读取透光率（t %），也可读取吸光度（a）。27 分析结果的表述试样中vb12 的含量按公式 (4) 计算： (4)式中：x试样中vb12 的含量，单位为微克

49、每千克表示（g/kg）；cx26.8.5 中计算所得的总平均值，单位为纳克（ng）；m 试样的质量，单位为克（g）；f 稀释倍数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。28 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15 %。29 其他本方法检出限为 1.0 g/kg。附录aa.1 液相色谱分离梯度洗脱参考条件表a.1.1 液相色谱分离梯度洗脱条件表时间 mina相 %b相 %初始85151.0 85152.0 67332.5 10903.0 10903.2 85155.0 8515a.2 质谱参考条件表a.2.1 离子源控制条件电离方式esi+毛细管电压（kv）3.2锥孔电压（v）25射频透镜1电压（v）14.9射频透镜2电压（v）14.7离子源温度（）150锥孔反吹气流量（l