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1、HPLC基础知识The Basic Knowledge of HPLC,色谱分析法简介 色谱法的分类 HPLC的特点及应用领域 HPLC的分类 HPLC相关的基本术语 HPLC的相关理论,目录,HPLC的定性分析 HPLC的定量分析 HPLC仪器的组成 输液泵 检测器 色谱柱 进样器 工作站,P230的基本操作 HPLC方法的建立 液相色谱常见问题及其对策 液相色谱容易出问题的部件 仪器的维修和保养,色谱分析法简介,色谱法是一种重要的分离分析方法 ，它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产

2、生了很大的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的,“色谱”的来由,俄国植物学家 茨维特（Tswett） 1906年，他将从植物色素提取的石油醚提取液倒人一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，然后用石油醚淋洗，结果使不同色素得到分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词也由此得名,色谱法的分类,1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）,液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）

3、和液液色谱（LLC） 随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC） 超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）,2.按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法,利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法 最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专

4、属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离,3. 按固定相的外型分类 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱 固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱,4. 按照展开程序分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为 洗脱法、顶替法、和迎头法 洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图,这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色

5、谱法中最常用的一种方法,顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相 很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图,此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用,迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图

6、,该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离,HPLC的特点,适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物,分离原理图解,优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好， 定量精度高，应用范围广,缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分 子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多,HPLC应用领域,HPLC是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域,HPLC的分类,高效液相

7、色谱法按照分离机制可以分为以下几类,液-固吸附色谱,液-液分配色谱,离子交换色谱,离子色谱,离子对色谱,排阻色谱,亲和色谱（AC）,液-固吸附色谱,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸附 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性,固定相与流动相均为液体（互不相溶） 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用。现今多采用化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。例

8、如：C-18柱（反相柱） 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配 对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反,液-液分配色谱,离子交换色谱 ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形

9、式等有关。亲和力大，保留时间长 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等,离子色谱 ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法,离子对色谱,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分

10、配 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配,排阻色谱色谱 size- exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布) 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰,亲和色谱(AC)

11、 Affinity chromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱,HPLC相关的基本术语,固定相 流动相 色谱流出曲线和色谱峰 基线和峰高 保留值 区域宽度 分离度 溶剂等级,液相色谱固定相 stationary phases of LC,定义：在HPLC分离过程中，在柱内静止不动的一相，即柱内填料,1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、

12、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体，早期采用 100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见 现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料,（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表 面附着一层厚度为1 2m 的多孔硅胶 表面积小，柱容量底,（3）化学键合固定相,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN C18 十八烷基硅烷键合硅胶,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快 （2）寿命长，化学键合

13、，无固定液流失，耐流动相冲击 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定 （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性 （4）有利于梯度洗脱,化学键合固定相的特点,存在着双重分离机制 (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率：分配为主 低覆盖率：吸附为主,2.液-固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等 结构类型：全多孔型和薄壳型 粒度：510 m,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面 涂约1%的离子交换树脂 （2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键 合型（键合离子交换基团） 树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸性 、弱酸性）

14、（2） 阴离子交换树脂（强碱性 、弱碱性）,4. 空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构 水为流动相。适用于常压排阻分离 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布,液相色谱的流动相 mobile phases of LC,1. 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动 相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况 （

15、2）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性 柱也称正相柱 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型 分离柱上的出峰顺序相反,2. 流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度淋洗和梯度淋洗 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 、乙腈、甲醇 、水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间,3. 流动相的选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据 采用正相液-液分配分离

16、时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙 醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳 二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4. 选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期 累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝 固定相等,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度

17、，防止产生沉淀 并在柱中沉积,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检 测器时，流动相不应有紫外吸收,色谱流出曲线和色谱峰,由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰 如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的,基线和峰高,基线 在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线 峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示,色谱流出曲线和色谱峰 基线（a） 峰高（h）,保留值,1.死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色

18、谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图,因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长L与tM的比值计算，即 = L/tM,2. 保留时间tR 试样从进样到出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图,3.校正保留时间tR,某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的校正保留时间， 即 tR= tR tM 由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间,保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留

19、时间常受到流动相流速的影响,4.相对保留值r2,1 某组分2的校正保留值与组分1的校正保留值之比，称为相对保留值 r2,1= tR2 / tR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此广泛用作定性的依据,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即 = tR (i) / tR (s) 式中tR (i)为后出峰的校正保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子,色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力

20、学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法,区域宽度,1.标准偏差-即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半 2.半峰宽Y1/2-即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为 Y1/2=2.354 3.峰底宽度Y-即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是 Y = 4 ,从色谱流出曲线中，可得许多重要信息： (i) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所 含组分的最少个数 (ii) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分 析 (iii) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定 量分析 (iv) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价 色谱柱分离效能的依据 (v) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定

21、相 （或流动相）选择是否合适的依据,分离度,分离度R是一个综合性指标 分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即 R = 2 (tR2 - tR1) / Y1 +Y2,R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7% 通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志,不同分离度时色谱峰分离的程度,分离度受柱效（n）、选择因子（）和容量因子（k）三个参数的控制,上式即为基本色谱分离方程式,在实际应用中，

22、往往用neff代替n处理上式可得,1.分离度与柱效的关系,由分离方程式看出，具有一定相对保留值的物质对，分离度直接和有效塔板数有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即,用柱长的色谱柱可以提高分离度，但延 长了分析时间。因此，提高分离度的好 方法是制备出一根性能优良的柱子，通 过降低板高，以提高分离度,2. 分离度与选择因子的关系 由基本色谱方程式判断，当 = 1时，R = 0。这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然

23、，大，选择性好。研究证明的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大值,3.分离度与容量因子的关系,如果设， Q =（ n / 4 ）（ - 1 / ） 那么： R = Q （k / 1+ k）,当k10时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取k为2-10最宜,控制k的方法：改变流动相的组成,4. 分离度与分析时间的关系,从图中tr /Q对k的曲线可见，当k在2 -5时，可在较短的分析时间，取得良好的分离度,溶剂等级,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高,纯

24、化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱

25、过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为,HPLC的相关理论,分配系数K和分配比k 塔板理论 速率理论,HPLC的相关理论,分配系数K和分配比k,1.分配系数K 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过程 这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 K=溶质在固定相中的浓度/ 溶质在流动相中的浓度 = Cs / Cm,分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特

26、征值，它仅与两个变量有关：固定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关,2.分配比 k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和 压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配 在固定相和流动相中的物质的量比。即 k = 组分在固定相中的物质的量 / 组分在流动相中的物质的量 = ns / nm,k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关,3. 分配系数K与分配比 k 的关系 K = kVS/VM =k .

27、其中称为相比，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为6-35；对毛细管柱，其值为60-600,4.滞留因子Rs,滞留因子Rs值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs,Rs若用质量分数表示，即,对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为,整理上面两式可得,4.分配系数 K 及分配比 k 与选择因子的关系 对A、B两组分的选择因子，用下式表示： = tR (B) / tR (A) = k（A） / k（B） =K（A） / K（B） 通过选择因子把实验测量值k与

28、热力学性质的 分配系数K直接联系起来，对固定相的选择具 有实际意义,如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件,下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓,图中KAKB ，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：,两组分的分配系数必须有差异 区域扩宽的速率应小于区域分离的速度

29、在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱,塔板理论,把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用 H表示，称为塔板高度，简称板高,塔板理论假设： 1. 在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H 2. 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm） 3. 所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略 4. 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无

30、关,简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为： n = L / H n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小,塔板理论指出： 第一 当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板 数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲 线 第二 当样品进入色谱柱后，只要各组分在两 相间的分配系数有微小差异，经过反复 多次的分配平衡后，仍可获得良好的分 离,第三 n与半峰宽及峰底宽的关系式为： n = 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 (tR / Y)2 式中

31、tR 与Y1/2 ( Y )应采用同一单位（时间 或距离）。从公式可以看出，在tR 一定 时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越 小，柱效能越高,在实际工作中，由公式 n = L / H 和 n = 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 (tR / Y)2 计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM， 所以常用有效塔板数n有效表示柱效： n有效= 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 ( tR / Y)2 有效板高 ： H有效 = L / n有效,塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观 点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，

32、解释了流 出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数 但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而 且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔 板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高 受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速 下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应 用,速率理论,速率理论基本方程 H = A + B / u + C u,式中u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数,上式也称范.第姆特（Van Deemeter）方程，速率理论吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力

33、学基础上较好地解释了影响板高的各种因素,1.涡流扩散项 A 在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散,涡流扩散示意图,由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定： A = 2dp 上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛

34、细管，不存在涡流扩散，因此 A = 0,2. 分子扩散项 B / u （纵向扩散项） 纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为 B = 2 Dg,B/u（纵向分子扩散项） 指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽,B = 2 Dm,式中： 弯曲因子，填充柱 1 空心柱 = 1 Dm组分在流动相中的扩散系数,由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略,3. 传质阻力项 Cu 液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液 界面

35、移动到液相内部，并发生质量交换，达到 分配平衡，然后又返回气/液界面的传质过程。 这个过程也需要一定的时间，此时，气相中组 分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于是 造成峰形扩张,液相传质阻力系数 C1为：,由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大,当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利于分离。虽然提高柱温可增大D1，但会使k值减小，为了保持适当的C1值，应控制适宜的柱温,HPLC

36、的定性分析,定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标 但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非专属的。因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法则可确定色谱峰所代表的化合物,1、利用纯物质对照定性,在一定的色谱条件下，一个未知物只有一个确定的保留时间。因此将已知纯物质在相同的色谱条件下的保留时间与未知物的保留时间进行比较，就可以定性鉴定未知物。若二者相同，则未知物可能是已知的纯物质；不同，则未知

37、物就不是该纯物质 纯物质对照法定性只适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，且有纯物质的未知物,2、相对保留值法,相对保留值is 是指组分i与基准物质s调整保留值的比值 is = tri / trS= Vri / Vrs 它仅随固定液及柱温变化而变化，与其它操作条件无关,相对保留值测定方法：在某一固定相及柱温下，分别测出组分i和基准物质s的调整保留值，再按上式计算即可 用已求出的相对保留值与文献相应值比较即可定性 通常选容易得到纯品的，而且与被分析组分相近的物质作基准物质，如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等,3、加入已知物增加峰高法,当未知样品中组分较多，所得色谱峰过密，

38、用上述方法不易辨认时，或仅作未知样品指定项目分析时均可用此法 首先作出未知样品的色谱图，然后在未知样品加入某已知物，又得到一个色谱图。峰高增加的组分即可能为这种已知物,4、保留指数定性法,保留指数又称为柯瓦（Kovts）指数，它表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标。它具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点 保留指数也是一种相对保留值，它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数作为相对的尺度，并假定正构烷烃的保留指数为n100。被测物的保留指数值可用内插法计算,例如，若确定物质i在某固定液X上的保留指数IiX 的数值。先选取两个正构烷烃作为基准物质，其中一个

39、的碳数为Z，另一个为Z+1，它们的调整保留时间分别为tR(Z) 和 tR(Z+1) ，使被测物质i的调整保留时间tR(i)恰好于两者之间，即tR(Z) tR(i) tR(Z+1) 。将含物质i和所选的两个正构烷烃的混合物注入其固定液X的色谱柱，在一定温度条件下绘制色谱图,内插法求IiX示意图,大量实验数据表明，化合物调整保留时间的对数值与其保留指数间的关系基本上是一条直线关系。据此，可用内插法求算IiX IiX = 100Z +（lg tR(i) - lg tR(Z)）/ （lg tR(Z+1) - lg tR(Z)）,保留指数的物理意义在于：它是与被测物质具有相同调整保留时间的假想的正构烷烃

40、的碳数乘以100。保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，与其它实验条件无关。其准确度和重现性都很好。只要柱温与固定相相同，就可应用文献值进行鉴定，而不必用纯物质相对照,HPLC的定量分析,定量分析的任务是求出混合样品中各组分的百分含量。它的依据是，当操作条件一致时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比。即： mi = fi Ai 式中mi为被测组分i的质量； Ai为被测组分i的峰面积； fi为被测组分i的校正因子,进行色谱定量分析时需要： （1）准确测量检测器的响应信号 峰面 积或峰高 （2）准确求得比例常数 校正因子 （3）正确选择合适的定量计算方法，将 测得的峰面积或峰高换算

41、为组分的 百分含量,1、峰面积测量方法,峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法 （1） 对称形峰面积的测量 峰高乘以半峰宽法 对称峰的面积 A = 1.065 h Y1/2 （2） 不对称形峰面积的测量 峰高乘 平均峰宽法 对于不对称峰的测量如仍用峰高乘以半峰宽，误 差就 较大，因此采用峰高乘平均峰宽法 A = 1/2 h（Y0.15 + Y0.85） 式中Y0.15 和 Y0.85分别为峰高0.15倍和0.85倍处的 峰宽,2、定量校正因子,色谱定量分析的依据是被测组分的量与其峰面积成正比。但是峰面积的大小不仅取决于组分

42、的质量，而且还与它的性质有关。即当两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同 因此，混合物中某一组分的百分含量并不等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中所占的百分率。这样，就不能直接利用峰面积计算物质的含量。为了使峰面积能真实反映出物质的质量，就要对峰面积进行校正，即在定量计算是引入校正因子,3、定量计算方法,1. 归一化法 把所有出峰组分的含量之和按100%计的定量方 法称为归一化法。其计算公式如下： Pi % = (mi / m) 100% = Aifi / (A1f1 + A2f2 + +Anfn) 100% 式中Pi %为被测组分i的百分含量； A

43、1、A2 An为组分1 n的峰面积；f1、f2 fn为组分1 n的相对校正因子,当fi 为质量相对校正因子时，得到质量 百分数；当fi 为摩尔相对校正因子时，得到 摩尔百分数 归一化法的优点是简单、准确，操作条 件变化时对定量结果影响不大。但此法在实 际工作中仍有一些限制，比如，样品的所有 组分必须全部流出，且出峰。某些不需要定 量的组分也必须测出其峰面积及fi 值。此 外，测量低含量尤其是微量杂质时，误差较 大,2. 内标法 当样品各组分不能全部从色谱柱流出，或 有些组分在检测器上无信号，或只需对样品中 某几个出现色谱峰的组分进行定量时可采用内 标法 所谓内标法，是将一定量的纯物质作为内 标

44、物加入到准确称量的试样中，根据试样和内 标物的质量以及被测组分和内标物的峰面积可 求出被测组分的含量,由于被测组分与内标物质量之比等于峰面积之比即 mi / ms =Aifi / Asfs 所以 mi = ms Aifi / Asfs 式中下标s代表内标物，i代表组分。若试样质量为m，则 Pi % = (mi / m) 100% = ms Aifi / Asfsm 100%,内标法的关键是选择合适的内标物，它必须符合下列条件： （1）内标物应是试样中原来不存在的纯物质，性 质与被测物相近，能完全溶解于样品中，但 不能与样品发生化学反应 （2）内标物的峰位置应尽量靠近被测组分的峰， 或位于几个被

45、测物之峰的中间并与这些色谱 峰完全分离 （3）内标物的质量应与被测物质的质量接近，能 保持色谱峰大小差不多,内标法的优点： （1） 因为ms / m比值恒定，所以进样量不必准 确 （2）又因为该法是通过测量Ai / As比值进行计算 的，操作条件稍有变化对结果没有什么影 响，因此定量结果比较准确 （3）该法适宜于低含量组分的分析，且不受归 一法使用上的局限,内标法的主要缺点： 每次分析都要用分析天平准确称出内标物和 样品的质量，这对常规分析来说是比较麻烦 的；其次，在样品中加入一个内标物，显然对 分离度的要求比原样品更高,3.外标法 外标法实际上就是常用的标准曲线法。首先用纯物质配制一系列不同

46、浓度的标准试样，在一定的色谱条件下准确定量进样，测量峰面积（或峰高），绘制标准曲线 进样品测定时，要在与绘制标准曲线完全相同的色谱条件下准确进样，根据所得的峰面积（或峰高），从曲线查出被测组分的含量,高效液相色谱仪,性能指标,噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1小 时，基 线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移 灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出 的信号大小 检测限：检测限指恰好产生可辨别的信号（通常用2倍 或3倍噪音表示）时进入检测器的某组分的量 线性范围：指检测器的响应信号与组分量成直线关系 的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量之 比,HPLC的仪器组成,HPLC仪器

47、流程,输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存,HPLC的重要组成部件,输液泵 检测器 色谱柱 工作站 进样器,输出压力高：一般至少要有1535MPa,最高有50MPa 流量范围大：分析型在0.110mL/min内连续调节，制备型要求在100mL以上 流量稳定：要求无脉冲，精度重复性在0.5%左右 耐腐蚀：能适合各种有机溶剂、水和缓冲溶液 其他：密封、小巧、便于清洗和维护等,输液泵,高压输液泵,

48、恒流泵,恒压泵,注射型泵,往复型泵,双泵头往复式柱塞泵,双柱塞往复式串联泵,高效液相色谱仪的输液泵一般可分为恒压泵和恒流泵，P230采用的恒流泵,往复型泵工作原理图,恒流泵中气泡的排除,打开放空阀,按仪器前面板的”冲洗”功能键,用大流量溶剂冲洗系统直到流出的液体连续,证明气泡已经排除 如果用”冲洗”状态仍不能吸液,可以用吸耳球或注射器在排液口抽吸,直至液体流出 如果仍然无液体流出,可能是阀球阀座粘连,取出单向阀,向单向阀两端分别吹气,一通一堵为正常,两端均堵说明阀球座粘连,需清洗阀球阀座,流动相的更换,更换互溶流动相,5、重新连接色谱柱，设定适当流速，当流动相流 出约30倍于色谱柱体积，并且检

49、测器基线平衡 后，流动相更换完毕,1、将新流动相置于储液瓶中,2、打开放空阀，启动泵使新的流动相从入空阀 出口流出20ml左右，观察管路内无气泡产生。,3、关闭放空阀，然后将进样阀与色谱柱相连接 端卸开，用小容器放置于过样阀的出口处,4、启动恒流泵，让流动相从进样阀出口流出10ml 左右,换缓冲液流动相,1、用水更换色谱系统中缓冲液 2、用水含水量量10%60%范围的溶剂冲 洗色谱柱中的盐 3、用新流动相更换水或冲洗色谱柱溶剂,检测仪,紫外检测器（包括二极管阵列检测器） 荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器,常用检测器,紫外检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：

50、比耳定律，AKCL 优点： 1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗提 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,二极管阵列检测器,色谱定性依据： 保留时间 常规紫外检测器 峰纯度 二极管阵列检测器,样品池,二极管阵列,光栅,D2 / W 灯,每一组分可在每一波长处得到一吸光度值,优点,1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰,荧光检测器,高灵敏度、高选择性 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应,示差折光检测器,除紫外检测器之外应用最多的检测器 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值

51、。差值与浓度呈正比 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数） 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱,有偏转式、反射式和干涉型三种,电导检测器,原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱 缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%) 主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子,P230采用UV230+紫外-可见检测器，它采用二极管阵列作为分光和光电检测元件，检测波长范围170nm-720nm，光源为氘灯和钨灯,色谱柱,Pinnacle C18 同Kromasil C18 羰基，脂

52、肪酸，甘油酯，脂溶性维生素，酞酸盐，类固醇 Pinnacle C8 同Kromasil C8 与C18柱相似，但对憎水成分时间比C18短 Pinnacle Cyano 反相和正相柱。比正相硅胶柱稳定。分析炸药，类固醇 Pinnacle Phenyl 聚和芳香烃，聚合芳香族脂肪酸 Pinnacle Amino 单、双糖类成分，配以等度分析和视差折光检测器 Pinnacle Silica 正相分离，中等比表面 Allure C18 对增水性和弱极性保留值最强，分析炸药和类固醇 Allure Basix 药物和其它含胺集团成分分析 Allure Acidix 酸性药物，非衍生氨基酸，烃基，磺酸基，含

53、磷物分离,Allure Silica 极性正相保留值高，比表面积大，B型硅胶填料 Ultra C18 羰基，脂肪酸，苯胺，巴比妥，脂溶性维生素，酞酸盐，类固醇，PTH氨基酸 Ultra aqueous C18 反相极性保留值高，适应90以上水性流动相 Ultra IBD 极性和非极性混合样品分析专用柱 Ultra C8 高纯，碱性钝化反相柱，应用广泛，LC/MS Ultra C4 缩氨酸和小蛋白分析，柱稳定 Ultra C1 可代替Ultra ODS或辛烷柱极性物质分析 Ultra Cyano 碱性药物，类固醇和其它碱性物质分析 Ultra Phenyl 聚合芳烃，烃，嘌呤，嘧啶，极性芳烃，脂

54、肪酸 Ultra Amino 单、二糖等糖类，酯类、苯胺、杀虫剂。弱阳离子交换剂 Ultra PFP 有机卤素化合物功能团的分类先导分析 Ultra Silica 正相分离，高比表面B型硅胶 Kromasil C4 同Pinnacle C4,现在我们的P230使用的是大连依利特生产的C18柱，规格：5um 4.6X200mm,柱填料基质,硅胶基质- pH 38 Al2O3 . nH2O - pH114 聚合物基质 - pH114,高或低pH下, 硅胶会溶解,化学修饰困难,孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损,C-18柱-性能影响因素,硅胶纯度 填料硅胶

55、的纯度与残留金属离子浓度 色谱柱尺寸 填料床的长度和内径 颗粒形状 球型或不规则型 粒径 平均颗粒直径,通常3-10m 表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/gram表 示 孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300,色谱柱物理性质,键合类型 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量 封端 键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,色谱柱化学性质,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响,短柱 (15-100mm) 运行时间短,柱压低 长柱 (150-250mm) 分辨率高,运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm

56、) 检测器灵敏度高 宽径柱 (3-21.2mm) 载样量高,颗粒形状 对色谱分离的影响 当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命,球形,不规则形,粒径 对色谱分离的影响 较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高. 3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5m的粒径,1.8m 3.5m 5m 7m 10m,表面积 对色谱分离的影响 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要,孔径 对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料

57、表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW 4,000, 选择 80 的孔径 样品 MW 4,000, 选择 300 的孔径,大孔径填料适用于大分子分析,大孔径300 全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子 Poroshell 色谱柱 高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽,色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔, 与孔内表面的键合相进行分离分配,键合类型 - 对色谱分离的影响 单齿键合： 提高传质速率, 加快色谱柱平衡 双齿键合： 增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载样量,碳覆盖率- 对色谱分离

58、的影响 高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长 低碳覆盖率：缩短运行时间,封端 - 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,传统键合及封端技术,固定相键合 二甲基硅烷,封端 四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R = C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,+,+,Cl,CH,3,Si,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3