第三十五章 DNA重组.ppt

1、第三十五章 DNA 重组,功能 类型 机制,重组的生物学功能,产生新的基因/等位基因的组合（在减数分裂交换期间） 产生新的基因（如抗体基因的重排） 特定的DNA元件的整合 DNA修复,重组原理的应用,用于染色体上的基因作图（重组频率与基因之间的距离相关） 培育转基因细胞和生物,重组的类型,同源重组 发生在近乎相同的序列之间（如在减数分裂） 位点特异性重组发生在具有一定相似性的序列之间，涉及特异性位点 转座重组DNA元件从一个位点转移到另一个位点，通常没有序列的特异性,同源重组,也称为一般性重组，它发生在含有同源序列的两个DNA分子之间，即在两个DNA分子的同源序列之间直接进行交换。进行交换的同

2、源序列可能是完全相同的，也可能是近乎相同的。细菌的接合、转导、转化和真核细胞的同源染色体之间的交换等都属于同源重组。,细菌的转化,细菌的接合,同源重组需要满足的条件,（1）在交叉区域含有相同或几乎相同的碱基序列； （2）双链DNA分子之间发生互补配对； （3）需要重组酶的催化； （4）形成异源双链； （5）发生联会,同源重组的Holliday模型,由Robin Holliday在1964年首先提出，后由David Dressler和Huntington Potter 在1976年提出修改，他们证明了Holliday中间物的存在。,两个同源的DNA相互靠近,两个DNA分子在相同的位置出现裂口,链

3、交换和连接,中间物称为Holliday中间物或Holliday连接.,1个分子相对于另外1个分子发生旋转,结构的分离,简单的Holliday模型,更现实的修改模型,分支迁移,Fig. 22.2,patch,修改后的单链断裂重组模型,电镜下的Holliday结构,双链断裂模型,重组由双链断裂启动 断裂双链是遗传信息的供体 酶无序列特异性 在2个同源DNA分子之间的第1个稳定的中间物是三链结构,大肠杆菌主要的重组蛋白,RecA RecBCD RuvA RuvB RuvC,RecA蛋白,RecA蛋白是一种多功能蛋白质，它参与大肠杆菌所有的同源重组途径，有单体和多聚体两种形式。多聚体由单体在单链DNA

4、上从53方向组装而成。 RecA的主要功能包括：（1）促进2个DNA分子之间链的交换；（2）作为共蛋白酶促进LexA 阻遏蛋白的自我水解 RecA蛋白在同源重组的具体作用分为3个阶段：（1）RecA的第一个DNA结合位点（初级位点）与单链DNA结合，包被DNA，形成蛋白质-DNA丝状复合物；（2）RecA的第二个DNA结合位点（次级位点）与1个双链DNA分子结合，形成三链DNA中间体，随后单链DNA侵入双链DNA，寻找同源序列；（3）RecA催化链交换，由被RecA包被的单链DNA从53方向取代双链DNA分子之中的同源旧链，形成异源双链，并发生分叉迁移,RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间

5、的交换,RecA蛋白促进单链DNA与双链DNA进行链交换,RecA蛋白单体的三维结构模型,RecA介导的链交换,RecBCD蛋白,由RecB、RecC和RecD三个亚基组成。 具有5种酶的活性外切核酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶。 RecBCD蛋白参与细胞内的RecBCD同源重组途径首先它与双链DNA分子自由末端结合，依靠其外切核酸酶V的活性同时降解DNA的2条链，然而，一旦遇到chi（）序列，RecD亚基就从复合物中释放出来，留下来的RecBC蛋白开始以解链酶的活性发挥作用，在水解ATP的同时，解开DNA双链，产生单链DNA，为RecA发挥作用铺平道路，最终起动了链交

6、换和重组反应。,RecBCD蛋白的作用模型,RuvA和RuvB,DNA解链酶催化分支迁移 RuvA四聚体与Holliday连接结合（两个亚基之间结合一个DNA螺旋） RuvB 是六聚体环，具有解链酶和ATP酶活性 2个拷贝的RuvB与Holliday连接结合（结合到RuvA和2 个DNA螺旋） 分支迁移沿着RecA介导的链交换方向进行,RuvA的三维结构,RuvA和RuvB的作用模型,RuvC的作用模型,RuvC蛋白,是一种特殊的核酸内切酶，催化Holliday结构的分离，因此被称为解离酶。 以对称的二聚体形式发挥作用，在Holliday结构的中央部位切开4条链中的2条，而导致Holliday

7、结构的拆分。 RuvC的作用具有一定的序列特异性，它作用的一致序列是5-(A/T)TT(G/C)-3，箭头为切点，因此，只有当分支迁移到该一致序列的时候，RuvC才有机会起作用。,The RuvABC Proteins & Migration of Holliday Junctions,5. Migration increases the length of heroduplexes, allowing for isomerization of Holliday Junctions.,6. RuvA binds & stabilizes Holliday Junction,7. RuvB th

8、en binds to RuvA/DNA complex,9. Isomerization probably does not require proteins or energy.,Fig. 22.31a,RuvC的作用模型,大肠杆菌几种重要的同源重组途径,（1）RecBCD途径 这是大肠杆菌最主要的重组途径。除了RecBCD以外，还需要RecA、SSB、RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶I、DNA 连接酶和DNA旋转酶。此外，还需要chi序列。 （2）RecF途径 这主要是质粒之间进行重组的途径，需要的蛋白质有RecA、RecJ、RecN、RecO、RecQ和Ruv等。 （3）Re

9、cE途径,Fig. 22.5 a-e,RecBCD同源重组途径,位点特异性重组,位点特异性重组是指在DNA特定位点上发生的重组，它需要专门的蛋白质识别发生重组的特异性位点并催化重组反应。尽管在很多情况下，它也需要在重组位点存在同源的核苷酸序列，但是，同源的核苷酸序列并不长。与同源重组一样，位点特异性重组也发生链交换、形成Holliday结构、进行分叉迁移和Holliday结构解离。 位点特异性重组可以发生在2个DNA分子之间，也可以在1个DNA分子之内。如果发生在2个DNA分子之间，通常会导致2个DNA分子之间发生整合；如果是发生在1个DNA分子之内，则可能发生缺失或倒位。 位点特异性重组的功

10、能包括：（1）调节噬菌体的整合；（2）调节基因表达；（3）调节胚胎发育期间程序性的DNA重排。,位点特异性重组的步骤,链交换 形成Holliday中间体 分支迁移 分离,缺失性位点特异性重组和倒位式位点特异性重组图解,位点特异性重组实例,噬菌体的整合 鼠沙门氏细菌鞭毛相的转变 抗体基因多样性的产生,噬菌体的位点特异性整合,处于潜伏状态的噬菌体要想长期稳定地存在于宿主细胞之中，它必须通过位点特异性重组的方式整合到大肠杆菌的染色体DNA上。而大肠杆菌染色体本来就有专门的位点供其整合，整合位点位于gal 操纵子和bio操纵子之间，被称为附着位点名为attB。attB只有30 bp长，中央含有15 b

11、p的保守区域，重组反应就发生在该区域，该区域通常被称为BOB，其中B 和B 分别表示细菌DNA在这段保守序列两侧的臂。 噬菌体的重组位点称为attP，其结构较为复杂，它的中央也含有与attB一样的15 bp保守序列，以POP表示，P和P分别表示两侧的臂。然而，attP两翼的序列非常重要，因为它们含有一系列参与重组反应的蛋白质结合位点。P臂长150 bp，P臂长90 bp。 噬菌体整合需要1种自身编码的蛋白质整合酶（Int）和1个宿主蛋白整合宿主因子（IHF）。两种蛋白质结合在P臂和P上，形成一种复合物，使attP和attB 的15 bp保守序列能正确地排列。Int催化了重组过程的所有反应，包括

12、一段7 bp长的分叉迁移。 重组的结果导致了整合的原噬菌体两侧成为两个附着点，它们的结构稍有不同，左边的attL结构为BOP，右边的attR结构是POB。,噬菌体的位点特异性整合,噬菌体重组整合或切除时切点的序列,酪氨酸重组酶与重组DNA的结合模型,酪氨酸重组酶的作用机制,鼠伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的转换,转座重组,是指DNA上的核苷酸序列从一个位置转位或跳跃到另外一个位置的现象，在原核生物和真核生物的基因组内均可以发生，发生转位或跳跃的核苷酸序列被称为转座子或可移位的遗传元件。与同源重组和位点特异性重组不同的是，转座子的靶点与转座子并不存在序列的同源性。接受转座子的靶位点可能是随机的，也可能具有

13、一定的倾向性（如存在热点或一致序列），这与转座子本身的性质有关。,细菌的转座子,插入序列（IS） 复杂型转座子 复合型转座子 Mu噬菌体,插入序列（IS）,这一类转座子具有以下性质： （1）较小，长度一般在700bp 1800 bp之间； （2）绝大多数两端含有10bp40 bp长的反向重复序列； （3）通常内部只有一个基因，编码的蛋白质是专门催化转位反应的转座酶（tnpA），没有任何抗生素或其它毒性抗性基因； （4）通过“剪切”和“粘贴”的方式进行转座，转座结束后可导致插入点序列重复。 （5）有少数IS，没有明显的反向重复序列，它们是通过复制（滚环复制）与粘贴的方式进行转座的。,IS的转座机

14、制,IS的结构,复杂型转座子,具有如下特征： （1）长度较长； （2）两侧含有较长的反向重复序列； （3）内部含有一个或几个结构基因。常见的结构基因有：转座酶基因tnpA，解离酶基因tnpR和抗生素抗性基因。 （4）转座完成以后可导致约5 bp长的靶位点序列加倍，从而在转座子两侧产生直接重复序列。,复杂型转座子的结构,复合型转座子的结构,Mu噬菌体的结构,复合型转座子,由2个插入序列和一段带有抗生素抗性或其它毒性抗性的间插序列组合而成，其中的2个插入序列位于转座子的两侧，相互间的方向可能相反，也可能一致。每一个插入序列具有典型的第一类转座子的特征，带有转座酶，它可能独立地转位，也可能与间插序列

15、一起作为一个整体进行集体转移。,Mu噬菌体,Mu噬菌体是大肠杆菌的一种温和性噬菌体，其DNA为线性双链，长度约为38 Kb，两侧无反向重复序列，基因组有20多个基因，但只有A基因（编码转座酶）和B基因（与复制和转座有关）与转座有关联。在转座的过程中，可引起靶位点序列重复。在溶源状态下，它能在宿主DNA的不同位置间随机转移。由于Mu转移的靶位点不固定，很容易造成宿主细胞的各种突变，其名称与它的诱变子角色有关。,真核生物的转座子,根据转座的机理将真核生物的转座子分为二类：第一类是反转座子，其转座过程是DNARNADNA，需要RNA中间体；第二类是DNA转座子，其转座过程是DNADNA，无RNA中间

16、体。 DNA转座子又分为复制型DNA转座子和保留型DNA转座子，其中，复制型在转位前后，原位置上的拷贝仍然存在，只是通过“复制”和“粘贴”的方式，复制一份到新的位点；而保留型在转座中，原来的拷贝被“剪切”后“粘贴”到新的位点，即原来的拷贝被原封不动地转移并保留到新的位点。 每一类转座子都有自主型和非自主型。自主型转座子的内部含有开放的阅读框架，自己编码转座所必需的酶或蛋白质；非自主型转座子缺乏足够的编码能力，却保留了转座所必需的顺式元件，在合适的自主型转座子编码的转座酶的作用下，它们照样可以进行转座。,玉米的Ac-Ds系统,McClintock在玉米基因组发现的Ac-Dc系统可谓是最有代表性的

17、例子。Ac代表激活元件，属于自主型，带有全功能的转座酶基因；Ds代表解离元件，属于非自主型，带有缺失的转座酶基因，由Ac突变而来。Ac和Ds之间关系密切，一“主”一“仆”，Ds单独不能移位，因为它不能合成转座酶。同一个细胞内，必须有Ac的存在，Ds才会移动。 如果Ac或Ds插入到玉米种子的紫色色素基因C内部，则紫色色素基因被关闭，使玉米籽粒不能产生紫色色素，而成为黄色；如果Ds从C内跳开，C所受的抑制作用即被解除，玉米籽粒又变成紫色；如果Ds跳到远离Ac处，或者Ac本身跳开，Ds即不受Ac的控制，它又可以发挥对结构基因SG的抑制作用，使玉米籽粒成为黄色。Ac和Ds跳动得如此之快，使得受它们控制

18、的颜色基因时关时开，于是玉米籽粒便出现了斑斑点点。,玉米的Ac-Ds系统,反转座子,反转座子在真核生物的基因组中占很高的比例，它在结构、性质和转位的方式上与逆转录病毒的复制很相似。首先是DNA被转录为RNA中间物，然后RNA中间物被逆转录成双链DNA，最后，双链DNA在新的位点上整合到基因组DNA上。 根据两端的结构，反转座子可进一步分为LTR反转座子和非LTR反转座子：前者的两端是直接的长末端重复序列；后者无LTR序列，但有一端终止于1小段重复序列（通常是poly A）。 无论是哪一类，仍然有自主型和非自主型之分。如果是自主型的，其内部含有gag基因和pol基因，但缺乏编码外壳蛋白的env基因。pol基因能够编码蛋白酶、逆转录酶、核糖核酸酶H和整合酶；如果是非自主型的，则内部序列大小变化很大，缺乏大多数或者全部编码功能。反转座子在某种意义可视为有缺陷的逆转录病毒。,反转座子的转座机制,LTR反转座子和非LTR反转座子的结构,转座的分子机制,“剪切”和“粘贴”机制 “复制”