实验五. 细胞染色体制备

1、了解组织培养细胞染色体的制备、实验5、实验目的实验原理实验试剂和仪器实验步骤注意事项、组织细胞的培养方法。 掌握染色体标本的制造方法。 一、实验目的二、实验原理二、实验原理、指数生长期的细胞，经短期培养后，用秋水仙碱处理，中期隔断细胞分裂，经低渗透、固定、滴片和染色，可得到大量中期分裂相的细胞，制作后可清晰的材料：具有强生长分裂能力的细胞系(Hela 白血病K562细胞、C2C12 BHK细胞等)仪器：恒温孵化器、离心机、显微镜培养瓶、移液管、载玻片试剂：培养液(RPMI1640，M199，DMEM等)、胎牛血清、双抗、NaHCO3、生理盐水。 使染色体收缩成一定的形状。 目的：获得大量中期分

2、裂相细胞。 2. Carnoy固定液新配置的甲醇：冰醋酸混合液(3:1 )。 迅速穿透细胞，固定和维持染色体结构的完整性，增强染色体的嗜碱性，达到优良的染色效果，3 .低渗透液(0.075M/L KCl )低渗透的目的是通过反渗透作用使细胞膨胀(但不破裂) 4 .染料(Giemsa )不是单一的染料，而是天蓝、伊红、甘油和甲醇的混合物，调制后原液被储藏，染色后染色质呈红色，细胞核呈蓝色。四、实验步骤，培养液4ml牛胎血清1ml，培养24小时，培养液1ml加1ug继续培养3-5小时，培养、秋水仙碱、培养瓶，取样，培养液1ml取自离心管10ml，1 .加固定，3-4滴固定液，轻轻喷射后7 .8 .

3、9 .空气干燥、Giemsa染色10min、细水流洗涤、染色、10 .11 .12 .、反之，少细长2 )低渗透后，要小心细微，轻轻地搅拌细胞， 要防止细胞膜破裂、染色体散逸3 )离心前均衡，离心速度过高，细胞块难以分解，相反细胞容易丢失4 )载玻片在清洁、必须预冷的片滴下时要将材料滴到玻璃板上，5、注意事项、实验步骤、 1 .秋水仙碱预处理收集1ml生长旺盛的细胞，轻轻地吹走，加入秋水仙碱1ul，继续培养(完成)6-8小时。 2 .前处理后的细胞以1000rpm离心5min去往上清的3 .低渗透处理：加入1ml低渗透液，轻轻吹走，使细胞再悬浮，然后加入7ml低渗透液，在室温下静置20min，

4、4 .预固定：加入3-4滴固定液后，轻轻搅拌，愈合1000rpm离心5min 5.固定：沿管壁缓慢加入3ml的固定液，2分钟后用吸引管轻轻吹走，使细胞分散，10分钟后，以1000rpm离心5min，去往上清的6 .二次固定：加入3ml的固定液，均匀喷涂，固定10分钟后去除上清液7.3次固定：重复步骤6，8 .制悬浊液：去除上清液后残留0.5ml的固定液，用吸引管轻轻吹散形成细胞悬浊液9 .滴片：将冷的载玻片倾斜30度，吸取细胞悬浊液，离开载玻片至少1m，形成载玻片空气干燥10 .染色：在干燥的载玻片上滴加Giemsa，染色10分钟，细水洗净后空气干燥11 .镜检：低倍镜下寻找染色体分散良好、染色适度的分裂相，油镜下观察染色体形态，修正数。小鼠中期细胞染色体(2N=40 )、小鼠染色体核型分析、人慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia )、Chr9和Chr22相互易位Chr9上的c-abl oncogene和Chr22上的其产物为融合蛋白一个细胞如果含有这种易位Chr，就会致病。 猫呼吸综合征(Cat cry syndrome )的临