分子生物学在微生物检验中的应用

1、分子生物学在微生物检测中的应用，湖南省疾病预防控制中心微生物检测科黄一伟、分子诊断学、分子诊断学在分子生物学理论的基础上，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源或外源生物大分子与大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断观、治疗和转归提供信息和决策依据。 分子诊断学的三个阶段，三个阶段： (1)利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断。 (2)基于PCR技术的DNA诊断，特别是定量PCR和实时PCR的应用，不仅可以检测宿主中多种DNA和RNA的病原体量，而且可以检测多基因致病细胞中mRNA的表达量。 (3)以含有基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等生物芯片技术为代表的高通量

2、密集型检测技术。 荧光定量PCR(real-time PCR )可以通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物，实时在线监测反应过程，结合相应的软件分析结果，修正测定样品的初始模板量荧光定量PCR校正光定量PCR校正是一种带有激励光源和荧光信号检测系统的PCR校正，通常包括计算机系统和相应的分析软件。 荧光定量PCR标记方法内掺杂染料SYBR Green I序列特异性探针taqmanmolecularbeaconsdualprobes (fret )引物特异性探针Amplifluor (Intergen )，SYBR-Green I，oligo 1333 Oligo 2: LC R

3、ed 640， 荧光共振能量传递Taqman探针的3端q荧光分子能够吸收来自5端r荧光分子的荧光，因此，通常该探针只能检测来自5端荧光分子的荧光，只能检测3端荧光分子的荧光信号，但如果溶液中存在PCR产物(模板)，则与探针产生适合核酸外切酶活性的基质，从探针切断与激活Taq酶的探针5的末端连接的r荧光分子，通过破坏2个荧光分子间的FRET而发出荧光，由于切断的r荧光分子的数量与PCR产物的数量成比例， 能够根据PCR反应液荧光强度计算初始模板的数量，荧光能量传递技术(fluorescenceresonanceenerge ) fret，x，x，分子信标，分子信标，引物特异性探测器，探测器，探测

4、器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器，探测器， 一、二、三、四、四、五、六、五、六、六、六、六、六、六、六、六、七、八、七、八、八、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、 实时观察产物的增加，反应对数期下降反应的非特异性将引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高PCR反应的特异性增加量的精确度，准确算法分析定量结果更快捷方便，不需要游戏、基因和蛋白质芯片， 原理基因芯片也称为DNA宏阵列(DNA chip )，它将大量目标基因或寡核苷酸片段有规律地高密度排列固定在玻璃板、硅片等固相载体上，利用与测定的标记样

5、品基因碱互补的配对原理进行杂交激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，计算机软件处理，大量信息，基因微阵列技术的优越性，基因微阵列技术作为高吞吐量检测新技术，同时可以检测数万个生物分子，目前，病原生物的监测与发现了不明的病原体例如SARS-CoV被确认应用了基因微阵列技术。 目前，国内外蛋白质芯片或基因芯片产品进展情况，国外：家网络生物系统公司(纳斯达克编码： CIPH )的蛋白质芯片系统已通过中国国家食品药品监督管理局(SFDA )的医疗设备审核。 这也是广谱仪器首次被认可在中国作为医疗仪器使用。affymetrix公司开发了通过测定P53基因有无变异来判断癌症可能性的P53芯片，并诊断了药

6、物代谢缺乏症细胞色素P450芯片。 成功的病例包括HBV、丙型肝炎病毒HCV、甲型肝炎病毒(HAV )、庚型肝炎病毒(HGV )、巨细胞病毒(CMV )、梅毒、弓形虫、结核菌等多种病原体的诊断基因芯片。 在肿瘤中，蛋白质芯片成功应用于诊断白血病、乳腺癌、心力衰竭等疾病的诊断，诊断用的抗体芯片有霍乱毒素、葡萄球菌内毒素b、赖氨酸和枯草杆菌球体的诊断。 国内：上海数康生物科技有限公司研制的多肿瘤标记蛋白质芯片诊断系统于2001年12月获得国家卫生行政部门颁发的新药证书和试制批文。 本实验室应用该诊断系统对12种肿瘤标志物甲氧西林(AFP )、癌胚抗原(CEA )、糖原199(CA199 )、糖原2

7、42(CA242 )、糖原(CA125 )、糖原153(CA153 )进行了人绒毛膜促性腺激素(- HCG )、人生长激素上海裕隆生物科技有限公司及曲阜裕隆生物科技有限公司研制的丙肝病毒分级抗体检测试剂盒(蛋白芯片)可同时检测血清或血浆中的抗HCVCore、抗HCVNS3、抗HCVNS4、抗HCVNS5及上述四种抗体的总抗体五项指标。 传统的丙型肝炎酶联免疫吸附(ELISA )法检测试剂盒只能一次检测初筛指标抗HCV总限量，采血量为ELISA法的1/5，具有丙型肝炎感染初筛和确诊双重功能，可反映丙型肝炎感染、治疗和病程后的情况。 此试剂盒还具有检测特异性强、灵敏度高、平行性好、成本低、操作简单

8、快速、自动化程度高等优点。 2004年6月24日获国家食品药品监察局颁发的新药证书。 这标志着我国生物芯片技术在临床免疫检测领域的再次成功。 瑞芯生物技术有限公司成功研制出乙肝基因多态性检测芯片、丙肝基因分型检测芯片、结核菌耐药性检测芯片、地中海贫血检测芯片等产品的rca(rollingcircleamplification ) lamp (loop-mediatedisothermalamplification ) NASBA (nucleicacidsequence )未知病原体检测新技术、高吞吐量测量序列DNA再(重)顺序芯片复用PCR与质谱结合、 未知病原体检测-高通量测量序列，ROC

9、HE购买454 GS 2.0，GS FLX 454生命科学公司在序列过程中采用纳米材料，使序列速度提高了100倍。 该生命科学利用微微型反应器进行了测序，这种新的测序方法虽然各个反应的读取碱基数和正确率不及毛细管电泳法，但由于一次反应数庞大，因而整体取得了高速突破。150-200bp (GS 2.0)、0.1GB 300-500bp (GS FLX ) 1GB每小时600Mbp (100倍Sanger法)一个人可以在100天内轻松完成30亿bp(3G )。 Solexa技术： Illumina Genome Analyzer测序仪的基本原理：可逆末端反应的4种碱基各标记4种不同的荧光，每个碱基

10、末端被保护基封闭，一次反应只能加入一个碱基，经过扫描，得到这种反应色这个保护基被除去，下一个反应得到了可以继续的碱基的精确序列1735bp的序列1GB，ABI买了AGENCOURT Solid系统的寡核苷酸连接和检查原理60bp 4GB，未知的病原体检查新技术Affymetrix基因芯片技术，Affymetrix 在国际生命科学和医学、植物和微生物等基础研究领域得到广泛认可，以该基因芯片技术为主要研究手段在国际科学杂志上发表的论文近4000篇，在Nature、Science和Cell等影响因素非常高的杂志上发表的论文有数百篇。 1 )劳伦斯伯利国家实验室和防御科学技术实验室利用AFFY基因芯片技术在9小时内一次鉴定3200种(微)生物，可以对环境样品中的原核和真核(微)生物进行快速分类和定量分析。 2 )美国CDC利用AFFYMETRIX公司研制的天花病毒再测序芯片对数百种天花病毒株进行鉴定和分类的更多分离物进行测定，使科学家能够更容易地将病原体亚型与患者的结果联系在一起，而哪种亚型毒性最强等3)Affymetrix和英国Health Protection Agency (