HPLC+色谱柱选择与方法应用.ppt

1、HPLC 色谱柱选择与方法开发,概要,固定相选择性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具,概要,固定相选择性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具,选择性因素,分离度 Rs= (1/4) (a-1) N k/1+k a= 选择性 N= 柱效 k= 容量因子,选择性是最重要的因素!,选择性因素,通过改变以下一点或几点来改善选择性: 温度 流动相 固定相 pH,温度,通常缩短保留时间 注意: 柱温限制 分析物温度限制,流动相,总则: 选择在分析物pKa +/- 2 pH的缓冲液 100%水相条件能改善极性保留(使用可在100%水相条件下使用的色谱柱) 等度 vs. 梯度,水相稳定性,几乎没有变化

2、色谱柱稳定,固定相选择性,疏水性 极性选择性 芳香选择性,疏水性,固定相的保留强度 通常用丁基苯的k值（容量因子）测量,疏水性,考虑: 键合相特性 (C18, C8, Phenyl, 等) 表面积 (m2/g) 键合相密度 (umol/m2),疏水性,C18 phases,C8 phase,300 C18 phase,疏水性,传统的色谱法使用 C18 好处: 亚甲基选择性 最佳的疏水选择性,疏水性,传统的色谱法使用 C18 缺点: 较长的保留时间 可能不保留极性化合物,极性选择性,下面两者之间的相互作用: 固定相的极性基团 分析物的极性官能团,极性选择性,提高极性选择性 极性端基封尾基团 极性

3、镶嵌基团 苯基固定相,极性选择性,色谱柱: Luna 5m C18(2) YMC-Pack Pro C18 Synergi 4m Polar-RP (醚连接的苯基柱) 150 x4.6mm 流动相:75:25 甲醇 : 水 流速: 1 mL/min 组分: 1. Estrone 2. Estradiol,极性选择性,芳香选择性,苯基基团 利用芳香环的作用 使用甲醇可增大选择性 较少疏水保留 通常 C3 + 苯基基团,芳香选择性,色谱柱: Luna 5m C18(2) 150 x4.6mm Luna5m Phenyl-Hexyl 150 x4.6mm Synergi 4mm Polar-RP15

4、0 x4.6mm 流动相:50:50 乙腈 : 20mM 磷酸钾 pH 2.5 流速:1.0 mL/min 组分:酸性的, 芳香化合物 1. Indoprofen 2. Ethyl paraben 3. Naproxen 4. Diflunisal5. Indomethacin 6. Ibuprofen,芳香选择性,C18(2) Phenyl-Hexyl Polar-RP,pH 对选择性的影响,pH 1 12 稳定性,pH 对选择性的影响,pH 对选择性的影响,pH 对选择性的影响,固定相选择性,C18 相,苯基相,概要,固定相选择性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具,Synergi Hy

5、dro-RP,极高的疏水性保留 极性端基封尾，100% 水相稳定 改善极性选择性,Synergi Hydro-RP,Synergi Hydro-RP VS. Luna C18(2),Luna C18(2),已证实的可靠的 C18 色谱柱 极低硅醇活性 重现性高,Synergi Max-RP,疏水性与 C18相似 但这是 C12 比多数C18高25%的游离硅醇覆盖率 碱性化合物获得更尖锐峰形,Synergi Max-RP,中性pH下的碱性药物,另一新的产品 (Gemini C18),Gemini C18,Luna C8(2) & C5,降低疏水保留 缩短运行时间,Luna Phenyl-Hexy

6、l,疏水 & 芳香选择性 低 LC/MS 流失 可再生的 & pH 稳定的苯基相,Synergi Fusion-RP,改善极性选择性,同时减少运行时间 极低 LC/MS 流失 100% 水相稳定,Synergi Fusion-RP,运行条件,流动相: 75 : 25 20mM 磷酸钾 pH 2.5 : 乙腈 流速: 1.5 ml/min 柱温: 室温 检测: 210nm 样品: 1. 马来酸 2. 氯苯那敏 3. 曲普利啶 4. 苯海拉明,Synergi Fusion-RP 4 80,典型的C18,极性保留时间更长,疏水保留时间更短,Synergi Polar-RP,极性 & 芳香保留 100

7、% 水相稳定 改善极性选择性,LunaSCX,含胺和聚胺化合物 咳嗽和感冒药物 吗啡和滥用药物 核苷，多肽和多肽图,概要,固定相选择性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具,方法开发工具,疏水性级别,固定相描述 & 色谱柱特点,吸附剂特性 & 应用,方法开发工具,方法开发工具,技术支持队伍 问题解答指南 Advanza讨论会 产品讨论会 方法开发讨论会,总结,固定相选择性 考虑固定相和化合物的疏水性、极性和芳香性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具,谢谢,Trademarks Xterra is a registered trademark of Waters Corporation YMC-Pack Pro C18 is a registered trademark of YMC, Inc. Synergi , Gemini, and Luna are trademarks of Phenomenex, Inc. Phenomen