PCR的注意事项.ppt

1、PCR技术 注意事项,引物的设计 引物在PCR反应的浓度,模板 模板的种类 模板变性温度,Taq DNA聚合酶使用注意事项,PCR缓冲液使用注意事项,PCR循环次数注意事项,防止污染的方法,引物类的注意事项,寡核苷酸（dNTP）使用注意事项,温度与时间的注意事项,注意事项,一、引物 两引物间距离决定扩增片段的长度， *两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置 由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。,引物的设计： 1.长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为2024个核苷酸。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位

2、点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5端加上额外的34个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。,2.两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”。,6.引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。,7.引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处,3.(G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。 4.引物内部应避免内部形成发夹结构,5.引物长度：15-30

3、bp，常用为20bp左右,引物在PCR反应中的浓度 1. 一般在0.11M之间。 2. 浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。 3. 一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。,二、温度与时间的设置,基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taw DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，

4、一般采用94变性，65左右退火与延伸（此温度Taw DNA酶仍有较高的催化活性）。,变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。,退火（复性）温度与时间：变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C

5、含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。,寡核苷酸（dNTP）,在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑 制Taq酶的活性,高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，可降低反应物的产量。 PCR常用的浓度为50200M，不能低于1015M。 四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。,Taq DNA聚合酶,由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加,模板的种类： 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转

6、录得到第一条cDNA。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。,模板,模板,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成 败与否的关键环节之一,模板变性温度 *是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。 *变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取9095。 *加入Taw DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95 ，以保持DNA聚合酶的活力。,PCR缓冲液: PCR的标

7、准缓冲液为1050mM的Tris Hcl缓冲液 和1.5mMgCl。 Mg2+的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。 Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低,反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR循环次数 *常规PCR循环次数一般为2540个周期。 *循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。 *循环反应的次数太少，则产率偏低。 所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。,PCR技术中最 令人头痛的 问题是：,易污 染,防止污染的方法,1：避免交叉污染勤换枪头和高压枪头和PCR管。2：引物设计要正确，选择可靠的生物公司合成引物，如果公司不好，给的引物会不出结果。据说上海生工不错。3：DNA提取要成功。4：引物和模板和体系所加的比例要合适，模板过量会抑制体系的反应,5：设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照用于结果可预知的样品，证明实验体系正常，防止PCR抑制造成的假阴性。阴性对照：不加模板的