内毒素光度测定法检查技术PPT演示课件.ppt

1、光度测定法BET检查技术,湛江安度斯生物有限公司 2009年3月,Page 1,1、光度测定法方法学分类 2、光度测定法原理 3、动态比浊法BET 4、终点比色法BET,2020/8/14,Page 2,1、光度测定法方法学分类,2020/8/14,Page 3,光度测定法（定量法检测）,浊度法,显色法,动态浊度法,终点浊度法,动态显色法,终点显色法,(比浊法),(比色法),2、光度测定法原理,光电转换原理 光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。 当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流I，我们称I为透光强度。,20

2、20/8/14,Page 4,入射光,反应混合物,透射光,光电池,I,透光容器,设：初始时的透光强度为Is，某时刻的透光强度为It定义1：透光度（Rt）： Rt=It/Is(%) 初始时It=Is，Rt=100%，Rt曲线变化趋势是由高至低。 定义2： 吸光度(OD)： OD= -lg(It/Is) 初始时It=Is，OD=0，OD曲线变化趋势是由低至升高。 选择不同的参数(Rt或OD)将得到不同变化趋势的动态曲线。,2020/8/14,Page 5,TAL与内毒素反应的动态曲线(Rt-T曲线),以透光度（Rt）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引起反应混合液透光度的变化连续地

3、描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：,2020/8/14,Page 6,Rt（%）,T（分）,动态曲线,100,孕育期,反应期,结束,TAL与内毒素反应的动态曲线(OD-T曲线),以吸光度（OD）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：,2020/8/14,Page 7,OD,T（分）,动态曲线,0,孕育期,反应期,结束,动态曲线的特点,把标准内毒素制备成三个浓度C1、C2、C3（ C1C2C3 ），分别与TAL反应，描绘出反应的动态曲线如下图：,2020/8/14,Page 8,分析动态曲线可看出：

4、 内毒素浓度越高，孕育期越短； 内毒素浓度越高，反应期曲线越陡； 内毒素浓度越高，进入结束期越快。,光度测定法BET试验的相关变量,2020/8/14,Page 9,C3,100,Rt（%）,T（分）,C2,C1,相关变量： 内毒素浓度(C) 透光度(Rt或OD) 反应时间(T),1）动态法原理,固定透光度(Rt)，建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线（C-T曲线），用供试品的反应时间比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。这里的反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值（Rt）的时间。,2020/8/14,Page 10,回归分析,Rt%,预设透光度值R0,LgT=b-kLgC,（1）建

5、立标准曲线,（2）测定样品内毒素浓度（Cs）,用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品(S)反应，得到反应时间Ts，比对C-T关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cs。,2020/8/14,Page 11,比对标准曲线,Ts,T(分),Rt(%),R0,Cs,92,2）终点法原理,固定反应时间（T），建立内毒素浓度与透光度关系的标准曲线（C-Rt曲线），用供试品的透光度比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。,2020/8/14,Page 12,Rt(%),T(分),C1,C2,C3,100,R1,R2,R3,预设反应终止时间T0,Rt,R3,R2,R1,C3,C2,C1,Rt=b-KC,回归分析,

6、（1）建立标准曲线,（2）测定样品内毒素浓度（Cx）,用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品（X）反应，得到透光度值Rx，比对C-Rt关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cx。,2020/8/14,Page 13,3、动态比浊法,试验仪器及器具 动态微孔平板仪或试管仪 BET软件 微孔平板、反应试管等,2020/8/14,Page 14,2020/8/14,Page 15,英国Lab Kinetics公司 ATi动态试管仪, 96孔,湛江安度斯公司开发的BET专用软件 “生物探针-2002”,2020/8/14,Page 16,美国Charles River Endosafe 便携式检测系统（P

7、TS）,美国 BioTek公司超级酶标仪，ELx808IU,使用96孔微孔板,LKM细菌内毒素动态试管仪 制造商：英国莱伯金耐特公司（Lab Kinetics Ltd.） 世界上第一台动态试管仪的生产商 目前世界上销量最大的动态试管仪 已经取得医疗器械许可证 完善的售后服务,2020/8/14,Page 17,仪器特点：1、体积小巧，占用空间小； 2、恒温性能、光学性能精密， 各孔温度均在370.2， 这是国内同类仪器无法达 到的。 3、配有专业的、操作简单的软 件系统。,ELx808IU型动态酶标仪 制造商：美国伯腾公司（BioTek） 功能强大的细菌内毒素检测仪器 丰富的面板操作及数据分析

8、，无需电脑可独立操作 可使用多个波长同时分析,2020/8/14,Page 18,动态比浊法试验程序,1、器具的准备 2、验证试验 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 3、检查法,2020/8/14,Page 19,1）试验器具的准备,2020/8/14,Page 20,凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。通常玻璃器具需经250 、60分钟的干烤处理,2）标准曲线的可靠性试验,试验目的 验证实验室的条件是否满足BET试验的要求 验证实验人员的实验技能是否满足BET试验的要求 验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等）是否满足BET试验要求,2020/8/14,Page

9、 21,1、试剂,2020/8/14,Http:/,Page 22,Page 22,Http:/,2、反应项目,将标准内毒素制备成至少3个浓度的稀释液，相邻浓度间稀释倍数不得大于10，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限 实验前，先预热动态仪，使其达到反应温度,2020/8/14,Page 23,3、溶液C的制备,2020/8/14,Page 24,E100,BET水,1.0ml,2.8ml,2.8ml,3.6ml,3.2ml,CSE,混合5分钟,E10,E2,E0.25,E0.03,CSE/E100,4、鲎试剂的准备, 取TAL 1支，用砂轮在安瓿颈划痕，擦拭后从安瓿颈处折断（避免玻璃屑落

10、入安瓿内）； 用刻度吸管或移液器准确吸取BET水1.25ml沿瓶壁加入安瓿内，轻轻摇匀，使内容物全部溶解（避免产生气泡）；,2020/8/14,Page 25, 取反应试管11支，按2.0 EU/ml、0.25 EU/ml、0.03EU/ml各浓度平行3管，NC平行2管标记；,5、软件系统的设置,进入动态仪系统软件，根据试验要求，设置相关参数，如反应时间、预设透光度值等。 填写相关的实验参数，使软件进入待采集状态,2020/8/14,Page 26,6、加样反应,先将复溶好的鲎试剂分装至各反应试管中，0.1ml/管； 分别将反应溶液加入各相应反应管中，一般按照从低浓度到高浓度的顺序加样，首先加

11、阴性对照溶液； 加样完成后，将每支反应管内的混合液轻轻混匀后，插入动态仪中反应,TAL,2.0EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.25EU/ml,CSE,0.1ml,0.03EU/ml,0.1ml,NC BET水,0.1ml,0.1ml,0.1ml,加样顺序从低浓度到高浓度,2020/8/14,Page 27,在动态仪中插入反应试管后，开始数据采集。,2020/8/14,Page 28,7、结果判断,药典要求 1、阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间 2、标准曲线的相关系数|r|0.980 厂家建议值 3、变异系数CV%10% 关于相关系数 当对一组数据作线性回归

12、分析时，以相关系数r表示其标准曲线的线性状况，即该组数据的相关状况。当r值为正时，表示该组数据呈正相关关系；r值为负时，该组数据为负相关关系。当r值的绝对值|r|=1时，其标准曲线的线性最好。,2020/8/14,Page 29,2020/8/14,Page 30,试验完成后进行数据分析,2020/8/14,Page 31,试验完成后进行数据分析,2020/8/14,Page 32,试验完成后进行数据分析,E0.3125,E0.25,E2,3 ）干扰初筛试验,目的及原理 只有在无干扰情况下，样品的内毒素检测结果才是有效的。 通过检测从供试品原液到其MVD或MVC之间的稀释液，计算内毒素回收率，

13、判断供试品浓度对BET的干扰情况。,2020/8/14,Page 33,试验步骤,1、供试品限值的确定 2、试剂的选择 3、供试品最大有效稀释的计算 4、反应溶液的制备 5、加样及反应 6、结果判断,2020/8/14,Page 34,干扰初筛试验举例,供试品限值 硫酸庆大霉素，100ml/瓶，5000U/ml； 药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U,2020/8/14,Page 35,试剂,本试验使用鲎试剂的检测范围为100.03EU/ml，选择标准曲线浓度为2、0.25、0.03EU/ml,2020/8/14,Page 36,最大有效稀释倍数的计算,光度测定法中，供试品最大

14、有效稀释倍数计算公式： MVD=cL/，其中为标准曲线最低点浓度 本试验，,2020/8/14,Page 37,MVD=,5000U/ml x 0.5EU/1000U,0.03EU/ml,=80（倍）,各反应溶液的制备,溶液C的制备,E100,0.4ml,3.6ml W,E10,S原液,0.4ml,3.6ml W,S10,备用液,溶液A的制备,E0.5,0.8ml,2.4ml W,备用液,2020/8/14,Page 38,溶液B的制备,2020/8/14,Page 39,加样及反应,取TAL两支，参照标准曲线可靠性试验中的方法将其复溶； 复溶鲎试剂后，运行软件，使其进入待采集状态； 将两支复

15、溶好的鲎试剂溶液合并在一起，轻轻混匀避免产生气泡； 将鲎试剂液分装至20支反应试管中，0.1ml/管； 将相应的溶液A、B、C、D加至反应管中，0.1mL/管，每浓度平行2管,E0.03,E0.25,E2,溶液C,溶液D,W,S20,S40,S80,S20E0. 25,S40E0. 25,S80E0. 25,溶液A,溶液A,溶液A,溶液B,溶液B,溶液B,2020/8/14,Page 40,结果判断,药典要求 1、阴性对照的反应时间（TD ）大于标准曲线最低浓度的反应时间（T） 2、标准曲线的相关系数|r|0.980 3、回收率R满足：50% R 200% 厂家建议值 4、变异系数CV%10%

16、,2020/8/14,Page 41,回收率的计算,光度测定法试验中，在供试品检查浓度的溶液中,添加标准曲线中点或靠近中点的内毒素浓度,根据回收的内毒素浓度与添加的内毒素浓度的比值(回收率R)，判断供试品溶液对试验的干扰程度。R的计算公式如下：,2020/8/14,Http:/,Page 42,Ct：试验测出的供试品溶液的内毒素含量 Cs ：试验测出的加入 m标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量 m：标准曲线的中点或靠近中点的已知浓度内毒素 光度测定法规定：当R在50200%之间时，认为在此试验条件下该供试品溶液对试验无干扰。,Cs-Ct, m,R=,Page 42,Http:/,本试验结果,2

17、020/8/14,Page 43,相关系数绝对值|r|=0.99490.980,TD（3600s）T,20倍回收率,40倍回收率,80倍回收率,试验有效,试验有效,有干扰,有干扰,无干扰,4）干扰试验,根据干扰初筛试验结果，确定选择供试品的无干扰浓度 选择3批供试品进行干扰验证试验 溶液的制备方法与干扰初筛试验相同,2020/8/14,Page 44,有干扰,不理想,无干扰,溶液的制备,A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液B为加入m内毒素且与A溶液有相同稀释倍数的供试品溶液C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液D为阴性对照,2020/8/14,Page 45,反应项目设置,3批样品都在同一浓度做

18、干扰验证试验 每浓度平行2管,2020/8/14,Page 46,接受标准,药典要求 1、阴性对照的反应时间（TD ）大于标准曲线最低浓度的反应时间（T） 2、标准曲线的相关系数|r|0.980 3、各批样品的回收率R满足：50% R 200% 厂家建议值 4、变异系数CV%10%,2020/8/14,Page 47,5）检查法（日常检查）,根据干扰试验结果，选择无干扰的供试品浓度进行BET日常检查 各反应溶液的制备及反应项目设置与干扰试验相同,2020/8/14,Page 48,结果判断,药典要求 1、阴性对照的反应时间(TD)大于标准曲线最低浓度的反应时间(T) 2、标准曲线的相关系数|r

19、|0.980 3、各批样品的回收率R满足：50% R 200% 厂家建议值 4、变异系数CV%10% 若供试品溶液A所有平行管的内毒素浓度平均值乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定，否则判供试品不符合规定 无复测要求,2020/8/14,Page 49,4、终点比色法BET,原理 当鲎试验的显色反应到达预设的反应终止时间（T0)时，反应混合液的吸光度值（OD）与内毒素浓度（C）成正比，利用标准内毒素建立OD-C的标准曲线，利用标准曲线定量测定供试品的内毒素含量。 仪器 分光光度计 酶标仪 37恒温仪,2020/8/14,Page 50,试验程序,1. 试验准备：仪器及用具等 2. 确定药品的细菌内毒素限值（L） 3. 选择终点比色法试剂盒 终点比色法鲎试剂 显色基质（底物） 工作标准内毒素（CSE） 4. 计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最低有效浓度（MVC） 5. 标准曲线的可靠性试验 6