体外构建婴幼儿组织工程化心肌的实验研究

1、 上海交通大学博士学位论文体外构建婴幼儿组织工程化心肌的实验研究姓名：邢万红申请学位级别：博士专业：儿科学（心胸外科）指导教师：徐志伟20060501 体外构建婴幼儿组织工程化心肌的实验研究 ；笥胰诤陨稀观察，胞核呈椭圆形，位于细胞的中央。心肌细胞与构建的细胞一支架复肌特异性肌球蛋白重链麮谋泶铮凳倍縋结果表明，构建的 诱导可在体外定向分化为心肌细胞，有望成为组织工程关键词： 上海交通大学博士学位论文篢， 瑆甌 簍，甌， ， 琲琣篢瑃 瑃甌 甊猼 符号说明 符号说明聚乳酸聚羟基乙酸每分钟转速 上海交通大学博士学位论文复制手段保存和汇编本学位论文。不保密口。日期：细莎年乡月侈日 增加手术次数和创伤

2、等不利特点。寻找能完全避免上述不足的理想补片材料一直是先心外科基础研究的热点之一，心肌组织工程则提供了一全新的思路和治疗策略。组织工程就是运用工程学和生命科学的原则和方法，研究哺乳类动物正常和病理组织的结构与功能的相互关系，并发展可恢复、保留或改善组织功能的生物替代品。心肌组织工程是组织工程的一个重要分支，就是应用组织工程的原理和技术，利用自体细胞体外构建具有自体心肌功能的组织工程化心肌。心肌组织工程包括种子细胞、生物材料和组织构建三部分。：胎儿心肌细胞研究最早 细胞来源带来的伦理和法律问题；二是由于作为一种异体细胞移植而带来的免疫排：心脏自体细胞移植有更大潜力达到移植心肌与自然心肌的同步收缩

3、，但实践中很难获得用于培养的组织，：胚胎干细胞 力微环境，构建心肌组织工程的细胞培养方法和培养系统，可为体外心肌细胞的生长提供较为理想的环境。近年来，研究者已设计出了多种提供动力环境的培养系统，如机械搅拌式反应器、灌注培养反应器、模拟微重力旋转生物反应器、固体旋转生物反应器等。研究者将心肌细胞种植在多聚物支架上，能在不同的生物反应器，不同的营养介质条件下生长。所形成的组织工程化心肌类似正常的心肌组织。萵钉 合医院所制定的伦理学标准并得到该委员会的批准。还魈 状位灰海舴翘谙赴院竺倒置相差显微镜下观察细胞的形态学变化，危痙。糜妗：培养箱中培养。每 嘌南赴的胰酶傻赴海琹入含牡吞荄嘌褐糜谂嘌洌计数标准

4、为个细胞以上者为一个集落。和结合的鼠。 上海交通犬学博学位论文赴咏诤倒王相差显微镜逋馀嘌世庑偷某上宋赴翁相差显微镜縤婴幼儿纳叱蔛形，接种后第 篢克隆形成率为琍骄，平均为甇。随着传代次数的增加克柚颎，图築部分表面标记流式细胞仪分析篢 脚先天性心脏病在我国有较高的发病率，居各种先天畸形之首。随着心外科技术及源于骨髓网状间质，具有多向分化潜能，是心血管组织工程较理想的种子细胞”。，但人的骨髓中考停嘉9撬柚凶艿牡讼赴维细胞样外观。 上海交通大学博士学位论文第二章第苫竦牡蛲觥虼耍孀糯问脑黾涌寺纬陕手鸾档停代以后已无明显 上海交通大学博士学位论文合医院所制定的伦理学标准并得到该委员会的批准。还魈現，掷胍

5、其他：苏木精溶液、乙醇、肌妆絀、二甲苯、中性树尤氲攘康牡吞荄煌耆嘌胄状位灰海舴翘谙赴院竺洗涤魏蠹尤隠完全培养液制成细胞悬液，以接种于六孔培养板。赴诤虾蟾晃:衛疞小时。 换液一次。周后供免疫细胞化学及透射电镜检查。过酒精一酒精一无水酒精一二甲苯溶液。树胶封片，晾干。胞浆中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。各抗体阴性对照采用缓冲液代替一抗， 篢琣 师克服当前材料的小足，提高手术疗效，提供了种全新的思路。理想的种子细胞是能否获得下程化心向管修复材料的要素之 第三章能力的微丝蛋白，广泛分布于骨骼肌、心肌、平滑肌等所有的肌型细胞中；属于细胞骨架蛋白，是心肌和骨骼肌细胞肌丝中的一种中间丝蛋白，是新生成熟平滑肌

6、、心肌、骨骼肌细胞中肌丝的主要构成成分之一，在维持肌纤维形态，通过连接细胞核与细胞膜而使肌小节之间信号联系方面起着重要作用，成纤维细胞中没有性细胞分化。 上海交通大学博士学位论文还魈电泳、转移装置 吞荄确拢毂迹罚罚， 结合的抗生物素抗体定影液诹障嗥鞑挠邢薰： 珽琼脂糖 酆厦痬，入离心管，迅速转入无菌室。尤氲攘康牡吞荄煌耆嘌胄痬，离心状位灰海舴翘谙赴院竺 吞荄嘌航小时。梯度酒精水化。漂洗：次。右豢梗过夜。 组织称重，切小块放入管中。 分别吸取：痸丙烯酰胺：双丙烯酰胺混合，灌胶前加入蚑：痸丙烯酰胺：双丙烯酰胺 混合，灌胶前加入蚑胶。用注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不样品准备：嬗。

7、上样染液。将准备好的样品液和生恒定电流下电泳至染料接近分离胶顶端。然后恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝 懔魈跫拢转移过夜。加入昙堑亩犊固逡越岷弦患犊固寮癏标记的抗生物素抗体凳倍縋检测组织工程化心肌相关基因的表达返腞抽提 浆器进行匀浆。的试剂匀浆的样品中加入的甆尤胍毂嫉牧课C扛鲅吩冉奔尤此时加试剂匀浆的样品中加入至少龅掖迹逑碦沉淀。振荡后，钟。溶解保燃尤胛轗酶的水用枪反复吹打几次，然后质量检测的电泳缓冲液和 电泳缓冲液至覆盖胶面几倍体积的甲醛上样染液，加髓于甲醛电泳：上样于胶孔中，紫外透射光下观察并拍照凳倍縋疌珹， 混合液轻弹管底将溶液混合，个，秒；退火温度，秒；，秒 由分钟。镉 秒；，秒；占

8、鈃，。各样品的目的基因和管家基因分别进行 骸盏己蟮南赴翁河盏己蟮挠锥鵅呈杆状或球状，较肥大，见图。图：诱导后细胞的形态学怪孟嗖钕晕祒赴芨刺锏目6咎合赴谥苤种剧后可见有大量的细胞外摹质 渗出等炎症反应的表现，见图。霹 煌笱学位论立分别在和苋霰攴詈蟛稥染色行组织学检查，结果表明细胞外基质逋夤菇墓袒募谥舶寺闶筇迥诤周怪孟嗖钕晕怠 禾逋夤菇墓袒募谥踩肼闶筇迥诤用嗖钕晕怠 ，蚦鹤橹疘程化心肌的免疫组化：鑓妊粜倒置相 上海交通大学博学位论文检测对组织工程化心肌相关蛋白的检测 篗在蛆织工程化心肌的表达体心肌中都表达，见图。 分析软件对图片上每个特异条带友座值的数字化结果质量检测 私煌学博十学位论女 ？闸搜学

9、位论文 海交。学位论女准品的测量值与理论稀释倍数蜘的标准偏差圜图：拴剥到的样品和梯度稀释标准品的荧光增长曲线 汉煌笱学位论文在正常心肌、对照纽和实验组的表达一一一 拷煌笱学位论立图：标准曲线表篶在正常心肌、对照组和实验组的表达 甇一 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基囡诓实时定量合昙刊图：检测到的样品和梯度稀释标准品的荧光增长曲线图标准曲线猘璽猘对燃纰 第四章培养，有较高的生长率，易于被诱导分化。移植无形成畸胎瘤的危险，且构建组织工程化心肌时，需要特定三维的立体支架，使接种的细胞能够定位、贴 第四章外基质形成，植入裸鼠皮下无红肿等炎性反应。细胞在细胞支架上接种密度的大小是影响心肌细胞在细胞支架生长好坏的重要律