primer design.ppt

1、引 物 设 计,引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物与PCR 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 引物设计实例,引物（primers),引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。,3,3,5,5,Sense primer,Antisense primer,引物的重要性,在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。,

2、引物设计原则,引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值（ 熔解温度） 引物3端 引物5端 引物二级结构 引物二聚体 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构,特异、高效,引物长度,一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。,碱基分布的均衡性,同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。,引物Tm值（熔解温度）,一般要求：55-65。 计算： 对于低于30个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗

3、略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15,引物3端,引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸。,引物5端,引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。 5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。 5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。

4、5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,引物二级结构,发夹结构 尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。,引物二聚体,引物二聚体(Dimer) 尽可能避免引物自身分子之间3端有较多碱基互补 上下游引物间二聚体(Cross Dimer) 尽可能避免上下游引物分子之间3端有较多碱基互补,引物的特异性与保守性,特异性：避免非特异性扩增 保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别,用Blastn软件进行分析比较,扩增区域的二级结构,模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。,引物与PCR,引物浓度：一

5、般为0.1-1mol/L 引物浓度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O (单位：L) 退火温度 最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of product) 25 一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。,在0.2 mL Eppendorff管内配置50 L反应体系：,引物与PCR,引物设计软件,Primer Premier 5.0 Primer 3 DNAman Oligo,如何使用Primer Premier 5.0,引物设计 一般PCR引物设计 （病原体检测） 带酶切位点引物设计（基因克隆） Realtime PCR引物设计 巢式PCR引物设计 多重PCR引物设计 探针设计,设计引物用于检测病例样本中是否存在结核杆菌感染,引物设计实例,Mycobacterium Tuberculosis Ag85a,获取目标序列,Mycobacterium Tuberculosis Ag85a,/,上机实习,从