分子生物学 (2).ppt

1、分子诊断学,华侨大学 分子药物所 硕士课程,第五章 测序技术及应用,概述,1,第一代测序技术,2,第二代测序技术,3,新型测序技术,4,概述： 1 测序技术是基因检测的黄金标准 2 测序技术获得遗传信息最丰富,Sanger法测序-第一代测序技术,测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段。 双脱氧核糖核酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。 将双脱氧核糖核酸进行不同荧光标记；PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的

2、DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4种双脱氧核糖核酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。,商业化测序服务： 3730测序仪 ： 电泳温度可达70，有助于去除二级结构的影响 良好温控装置保证片段分析准确性及重现性好 新的液体分离胶(POP7TM Polymer)使通常读序长度即可达800bp 新型碱基识别与质量评分软件，提高测序准确性 毛细管内荧光检测，灵敏度高 双光束双侧激光激发，荧光信号强度高度均一 高灵敏度提高了测序模板DNA的浓度范围,PCR产物：条带必须单一，纯度OD260/O

3、D280=1.62.0。 溶解在灭过菌的去离子水中，浓度要求50 ng/l，提供10l以上。 同时提供PCR引物，并注明浓度，一定要提供经PAGE纯化的引物，浓度大于5pmol/l,第二代DNA测序技术 这两年发展迅猛的第二代测序仪Illumina的Genome Analyzer、 Roche 454的GS系列 ABI的SOLiD系统 让人类基因组重测序的费用蹭地降 低到10万美元以下。,1 高通量：40万到400万条序列； 2 读取长度根据平台不同从25bp到450bp ； 3一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数 ； 4 边合成边测序。,边合成边测序的实时测序技术-焦磷酸测序 Pyr

4、osequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP,若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。,不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色， 具有大通量、低成本、快速、直观的特点。与Sanger测序法相比，焦磷酸测序技术有其特定的优势。 ？比较两种测序技术优缺点 应用：单核苷酸多态性(single ucleotide polymorphism，SNP)，遗传多态性，植物多态性分析，分子诊断细菌与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定及药物基因组学等方面都有广泛的应

5、用。,焦磷酸测序用于基因表达量分析：,1 Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术,GS FLX 高通量测序方法原理示意图,1 文库制备： 基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）；,2、Emulsion PCR： 1）磁珠捕获：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。 2）乳化体系制备：磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增 3）扩增：整

6、个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。 4）乳化体系破坏：乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后 续的测序实验,3、测序反应： 携带DNA的磁珠与其他反应物混合物，随后放入PTP板：PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。 然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。 每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机捕获 ；,4、数据分析： GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析, 速度快：一

7、个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对。比传统的Sanger测序的方法快100倍； 读长长：单个序列的读长更长，平均可达到450个碱基左右； 通量高：每个反应可以得到超过100万个序列读长，成本大大降低； 准确度高：读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%； 一致性好：测序结果一致性超过99.99%；,PCR产物的超精细测序（应用于医学研究的重测序） 混合的肿瘤样本中识别体细胞突变 群体水平上发现高可信度的SNP位点 研究DNA的甲基化模式来进行基因调节的研究 基于基因测序变化进行毒性预测 进行流行病学分析,Illumina Genome Analyzer平台： 是一种基于

8、单分子簇的边合成边测序技术 测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell）， 这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。 然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。,1文库制备 样品收集，基因组DNA打断 DNA 末端修复 连接接头 2、DNA片段在Cluster Station上成簇扩增 准备Flowcell和试剂，安装到Cluster Station 将样品DNA连接到Flowcell；完全自

9、动化完成Cluster制备；,3、DNA簇在Genome Analyzer上边合成边测序 将Flowcell和试剂，安置到Genome Analyzer； 3羟基末端带有可化学切割的部分，只容许每个循环掺入单个碱基。用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3端粘性，继续聚合第二个核苷酸。 4、Paired-End Module 5、数据分析,技术特点： 测序通量高：每个测序反应能达到3G以上的数据通量； 准确率高： 98.5%，同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题； 低成本：比传统毛细管测序技术成本的1%还低； DNA序列的读取

10、长度不断增加：当前达到200 bp； 可以进行Pair-End双向测序，目前Pair-End文库插入片段大小范围可由200bp到10kb；,ABI 高通量SOLiD测序平台（supported oligo ligation detetion ) 以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。,a. 文库制备： 片段文库(fragment library)：片段文库就是将基因组DNA打断，两头加上接头，制成文库； 配对末端文库(mate-paired library)：基因组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然后用

11、EcoP15酶切，使中间接头两端各有27bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。,b. 乳液PCR/微珠富集 在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR（Emulsion PCR）。 PCR完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板经过3修饰，可以与玻片共价结合。 SOLiD系统的微珠要小得多，只有1 um。,c. 微珠沉积3修饰的微珠沉积在一块玻片上。 在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。 每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。,d. 连接测序 SOLiD连接反应的底物是8碱基单链

12、荧光探针混合物 ，5末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。 探针3端15位为随机碱基，可以是ATCG四种碱基中的任何一种碱基，其中第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区，双碱基编码矩阵规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜色的对应关系，而 35位的“n”表示随机碱基； 68位的“z”指的是可以和任何碱基 配对的特殊碱基。,1 单向SOLiD测序包括五轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应。 探针杂交：第一轮测序的第一次连接反应由连接引物“n”介导，由于每个磁珠只含有均质单链DNA模板，所以这次连接反应掺入一种8碱基荧光探针， 测序反应1：

13、SOLiD测序仪记录下探针第1、2位编码区颜色信息，随后的化学处理断裂探针3端第5、6位碱基间的化学键，并除去68位碱基及5末端荧光基团，暴露探针第5位碱基5磷酸，为下一次连接反应作准备。 测序反应2：第一次连接反应使合成链多了5个碱基，所以第二次连接反应得到模板上第6、7位碱基序列的颜色信息，而第三次连接反应得到的是第11、12位碱基序列的颜色信息,测序反应3 ：几个循环之后，引物重置，开始第二轮的测序。由于第二轮连接引物n-1比第一轮错开一位，所以第二轮得到以0，1位起始的若干碱基对的颜色信息。 五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2位. 的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得

14、到由“0，1，2，3”组成的SOLiD原始颜色序列。,e. 数据分析 由于双碱基编码规则中双碱基与颜色信息的简并特性（一种颜色对应4种碱基对），所以一个错误颜色编码就会引起“连锁解码错误”； 由于SOLiD系统采用了双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误； SOLiD数据分析软件不直接将SOLiD原始颜色序列解码成碱基序列，而是依靠reference序列进行后续数据分析。,1超高的测序通量：测序通量大于20GB/次，读长可达50个碱基（随机片段测序）和250个碱基（末端配对测序） 2, 无可匹敌的准确度：基于连接反应高度可靠的测序技术，创新的双碱基编码技术，可选择

15、性重复连接反应步骤 3, 系统的易操作性：样品制备支持随机片段文库和最高达10Kb插入片段的末端配对文库。,4, 系统的灵活性：两个独立控制的流动池，可以进行一张或二张玻片的同时分析。开放式高密度磁珠沉置，每张玻片可分为1个，4个或8个测序区域，支持多重技术； 5, 应用广泛灵活：超高通量的数据支持大规模测序和结构变异性分析。独特的双碱基编码特性使系统具备自检功能，对单核苷酸多态性（SNP）的检测精确率可以达到最高。 6 除了测序和重测序，还能进行全基因表达图谱分析、SNP、microRNA、ChIP、甲基化等多种分析。,三大测序平台比较： 1在新一代测序技术中，GS系统是最多产的 截至200

16、8年9月，已经发表了250多篇高质量的paper。其中Nature 20篇、Science 13篇、Cell 6篇、Genome Research 20篇、PNAS 24篇。 2 Illumina 性价比较高 Illumina的售价约为45万美元，低于454 GS FLX的50万和SOLiD系统的59万（以上皆为美国的售价）；综合考虑通量、运行时间和样品量； Illumina Genome Analyzer，因为每轮的运行费用为3000-4000美元，低于其他两种平台。,平均采购一台新一代测序仪大约要花费50万美元，除非该实验室测序的工作量非常大，否则是不会考虑购买的。 即使像Polonato

17、r这样的新一代测序仪也需要花费15万美元左右，这笔费用对于一个小实验室来说是无法承受的。 新一代测序技术对于测序市场来说的确会带来一定的冲击，不过要完全取代传统测序方式还需要一定的时间。,第三代测序技术-单分子测序技术 2008年4月Helico BioScience公司的Timothy等人在Science上报道了他们开发的真正的单分子测序技术，也被称为第三代测序技术； 它完全跨过了上述3种高通量测序 依赖的基于PCR扩增的信号放大 过程，真正达到了读取单个荧光 分子的能力，向1000美元测定一 个人类基因组的目标迈出了一大步。,Helicos的遗传分析系统：已上市， Pacific Bios

18、ciences：准备在明年推出单分子实时（SMRT）技术。 Oxford Nanopore的纳米孔（nanopore）测序：还尚未有推出的时间表，但有可能是这三种当中最便宜的。,1 测序速度快：实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍 2 读序长：实现了DNA聚合酶内在自身processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列 ，几千个bp； 3 精度非常高：达到99.9999% 4直接测RNA的序列 ：将大大降低体外逆转录产生的系统误差。 5直接测甲基化的DNA序列：实际上DNA聚合酶复制A、

19、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。,Helicos的遗传分析系统： 美国麻省剑桥（Cambridge）的Helicos Biosciences，也许是最早致力于单分子测序技术研发的生命科学公司。Helicos的被称作TRUE单分子测序技术（true single-molecule sequencing, tSMS）的新型测序方法，是一种基于合成的单分子测序技术 。,1 将待测DNA链打断成100200个碱基长度的片段，然后将已知序列的接头通常为多聚A （poly（A）尾巴，接到上述DNA片段末端； 2 将待测片段连接到界面上，然后将已标记的单

20、核苷酸和聚合酶的混合物加至界面。 3 标记核苷酸在聚合酶催化下按照碱基互补原则掺入待测片段中，之后，HeliScope仪器上的照相机会对整个界面进行成像，并鉴别所有掺入标记核苷酸的片段。 4 将标记基团切掉，然后在聚合酶作用下再掺入另一个标记核苷酸。通过对这一步骤进行反复循环，加入四种核苷酸，该仪器在单次运行中，即可对上十亿的待测链进行测序，读长在25至45碱基之间。,Helicos Biosciences的单分子测序技术示意图,1基因组的DNA断开成许多很小的片段，这些小DNA片段制成溶液后滴入测序仪内的金属薄片上分布着3000个纳米级小孔（直径不到70纳米），小DNA片段会分散到不同的纳米

21、孔中； 2每个纳米孔中涂有一种特殊的酶DNA聚合酶：DNA聚合酶的特性是，能够沿着DNA片段的双链结构游动，在游动的过程中将DNA片段的双链结构打开，分成两个片段，也可为某个DNA单链找到对应的片段，重新组合在一起 ；,3DNA片段在纳米孔中分散完成，向聚合酶分子滴入磷光染色剂做过标记的核苷酸溶液，一旦DNA片段中有核苷酸与之配对，标记物就会发出特定颜色的光； 4 金属薄片的底部也有一个缩微版光谱仪，检测并记录下这些闪光，测序仪从而记录下每个DNA片段中的碱基对顺序。 测序速度为每秒钟10个碱基对，2013年上市的测序仪将达到每秒测定1万个碱基对的速度。,基于纳米孔的单分子读取技术: 测序时D

22、NA分子依靠被称为核酸外切酶的蛋白质，一次一个碱基地通过小孔。这个酶能区分出4个DNA碱基的编码A、G、C、T，也可以检测出各个碱基是否被甲基化。一个单孔能在大约7O天时间内测定一个完整的DNA序列。 ，纳米孔公司已经研发出包含几百个纳米孔的芯片，可以在机器上快速廉价地大量进行DNA排序。,复合探针-锚定分子连接纳米孔法 ： 1）预制（准确的框架）基因组DNA纳米芯片缩小了所需试剂容量，并且能加快成像每次成像能捕捉到更多的DNA点； 2）新颖的试剂（复合探针-锚定分子连接）能对70个DNA碱基对进行单独序列阅读每个碱基对的阅读都是完全独立的，这种序列阅读利用的是低浓度低成本试剂。 3）1.样品准备和文库构建；2.DNA芯片分析；3.成像，组装和分析；4.复合探针-锚定分