基因工程(第二章答案)

1、第二章 基因工程工具酶一、解释下列名词1.Restrictionandmodification（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。 2. Matchedends(or cohesiveend)（匹配末端或粘性末端）识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端 3. Bluntends平末端。在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。4. Staractivity星星活性。在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序

2、列，这个改变的特殊性称星星活性。5. Klenowfragment Klenow 片段。Klenow DNA 聚合酶是 E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去 5-3 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和 3-5 外切活性不受影响。6.Reversetranscriptase反转录酶。即依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，它有 5-3 合成 DNA 活性，但是无 3-5 外切活性。7.Terminaltransferase（末端转移酶） 8.Ligase连接酶。催化 DNA 5 磷酸基与 3 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。9.T

3、4polynucleotidekinase（T4多聚核苷酸激酶）催化 ATP 的 -磷酸基转移至 DNA 或 RNA 的 5 末端。 10.Alkalinephosphatase（碱性磷酸酶）催化除去 DNA 或 RNA 5 磷酸 11.S1nuclease Sl 核酸酶。可降解单链 DNA 或 RNA ，产生带 5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对 dsDNA ，dsRNA ， DNA:RNA 杂交体不敏感。 二、填空题 1.限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）的命名是按属名和种名相结合的原则的，通常第一个大写字母取自（属名的第一个字母 ），第二、三个字母取自（

4、种名的前两个字母），第四个字母则用（菌株名）表示。 2.型限制酶识别回文对称序列，在回文序列（内部）或（附近）切割DNA，产生带3OH和5P基团的DNA的产物，需（Mg2）的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。3. 识别相同序列的限制酶称（同裂酶 ） 4.DNA载体经Hind切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的方法有（去磷酸化）、（部分补平）。 5.完全的回文序列应具备两个特点即（能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对）和（两条互补链的 5-3 的序列组成相同，即将一条链旋转 180，则两条链重叠 ）。 6.限制性内切核酸酶

5、（Restrictionendonuclease）通常保存在（50%）浓度的甘油溶液中。 7.载体和外源DNA经酶切，在进行下一步操作前，需消除限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）的影响。常用的方法有（EDTA 法）、（加热法）、（苯酚抽提法）、（试剂盒除酶法）。 8.对DNA进行双酶切时，酶切缓冲液的选择原则有(1)（）、(2)（）、(3)（） 9. KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymerase经蛋白酶裂解而从全酶中除去( ) 活性的多肽大片断，而其他活性保持不变。 10. E.coliDNA连接酶与T4DNA连接酶相似，但需（）的参与。 1

6、1. T4多核苷酸激酶在高浓度的ATP时发挥最佳活性，（）是其强烈抑制剂。 三、选择题：从备选答案中选出正确的结果，正确答案是唯一的。1.限制性内切酶一般保存在（C）浓度的甘油溶液中。 A 10% B 20% C 50% D 60%2.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶（C）A. 既可以作用于双链DNA，又可以作用于单链DNA B. 只能作用于单链DNAC. 只能作用于双链DNA D. 只能作用于RNA3.已知某一内切酶在一个环状DNA上有4个切点，当用此酶切割该环状DNA，可以得到（ B ）个片段 A. 3 B.4 C.5 D. 64.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶

7、星星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（A）以下 A. 5% B. 10% C. 20% D. 30%5.在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制哪一项最好（D） A. 反应体积Error! Reference source not found. B. 酶反应温度 C. 反应时间 D.酶量6.下列试剂中，哪一种可以螯合Ca2离子（） A. EDTA B. 柠檬酸钠 C. SDS D. EGTA7.DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能（C） A. 蛋白质（如BSA）同DNA结合 B. 有外切核酸酶污染 C. 酶失活 D. 酶切

8、条件不适合 8. nick与gap的区别在于（A） A. 前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指DNA的单链中有较小的缺失 B. 前者是是指DNA的单链中有较小的缺失，后者是指断开了一个磷酸二酯键 C. 二者无本质区别 D. 前者无法回复，后者可9.Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了（ ）活性 A. 5-3外切酶 B. 5-3合成酶 C. 转移酶 D. 3-5外切酶10.限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。命名时（A） A. 属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） B. 种名第一字母，属名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） C.

9、 属名第一字母，亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） D. 种名第一字母，亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）11.以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（A） A. 识别相同序列的限制酶称同裂酶 B. 可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶 C. 同裂酶的切割位点一定相同 D. 同裂酶的切割位点不相同 12 .BAP与CIAP的区别在于（ ）A. BAP 68时失活，而CIAP 68稳定 B. CIAP 68时失活，而BAP 68稳定 C. 二者均耐酚抽 D. 二者均不耐酚抽13.下列哪一种酶作用时需要引物（B） A. 末端转移酶 B. 反转录酶 C. DNA连

10、接酶 D. 限制酶14.限制性内切核酸酶可以特异性地识别（C）A. 特定的三联密码 B. 双链DNA的特定碱基对 C. 双链DNA的特定碱基序列 D. 单链DNA的特定碱基序列15.DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，下列对DNA连接酶的描述中，那项是正确的（A） A. 将双链DNA分子中的5磷酸基团同3OH末端重新形成磷酸二酯键B. 作用时不消耗能量 C. 需要Mn2+等二价辅助离子 D. 也可以是RNA分子16.下列酶中，除（）外都具有磷酸酶的活性 A. BamH B. CIAP C. 单核苷酸激酶 D. BAP 四、简答题1.简述限制性内切核酸酶（Restrict

11、ionendonuclease）的概念及其生物学功能？定义：指识别 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶。生物学功能：保护宿主不受外来 DNA 分子的感染，可降解外来的 DNA 分子，从而阻止其复制和整合到细胞中2.PCR引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加 34 个碱基。3.试回答影响限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）切割效率

12、的因素？外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的构象。4.在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？5.何谓Staractivity？简述Staractivity的影响因素及克服方法？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。引起星星活性的的因素：高甘油浓度（5%）；酶过量（100U/ml）；低离子强度（8.0)；有机溶剂如 PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）和

13、sulphalane 等；用其它二价阳离子 Mn2+、Cu2+、Co2+ 或 Zn2+ 代替 Mg2+ 。星星活性的抑制措施：减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；提高离子强度到 100150mM （在不抑制酶活性的前提下）；降低反应 pH 至 7.0 ；使用 Mg2+ 作为二价阳离子。 6.某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？生物体内的 DNA 序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化的限制酶 DpnI 来切割非甲基化的序列时，就

14、会出现不能切割的情况。 7.天然的质粒载体（plasmidvectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。试问在此过程中如何增减酶切位点？在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。将产生的 5 突出端补平后，再连接以产生新的酶切位点；同尾末端的连接，不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失；平末端的连接8.大肠杆菌DNA聚合酶，具有3-5外切活性和5-3的聚合酶活性以及5-3的外切活性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途?9.BAP和CIAP有何作用？为何一般采用CIAP而不采用BAP？10.依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶和T4或T7噬菌体RNA聚合酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？将 T7 RNA 聚合酶基因置于 E.coli lacUV5 启动子之下，插入到 噬菌体中，感染 E.coli ，建立稳定的溶