单克隆分离与挑选

1、单克隆的分离与挑选1. 在正式开始工作前1-7天时间内准备好：将菌种mm294在LB琼脂培养基的平板上划线，和将mm294 /含氨苄西林抗性基因的菌种在LB琼脂和氨苄西林的培养基的平板上划线。将其在37 C下培养过夜。培养好后将平板，用封口膜或者塑料膜包起来放置在4并干燥的环境中。2. 实验准备: 2个LB琼脂平板 2个LB氨苄西林的平板3. 在平板的底部做上清晰的标记，（不要写在盖子上）。4. 在37下预热材料：培养的菌和平板 支持和仪器2个LB琼脂平板 含有10%漂白粉的垃圾袋2个LB氨苄西林的平板 或者其他的消毒措施培养好的mm294LB琼脂平板 实验用煤气灯培养好的mm294/氨苄西林

2、LB氨苄西林的平板 接种环 记号笔平板划线技术：1. 在平板上写上你的标记和日期用记号笔，每个平板都预先写上LB琼脂或者LB琼脂+氨苄西林2. 选择两个LB琼脂平板，一个标记-PAMP(氨苄阴性)细菌不含质粒，另一个标记+PAMP(氨苄阳性)细菌含质粒。3. 选择两个LB琼脂+氨苄西林平板，一个标记-PAMP(氨苄阴性)细菌不含质粒，另一个标记+PAMP(氨苄阳性)细菌含质粒。4. 像握铅笔一样握住接种环，在灯上烧接种环，烧到环呈红热状态，然后继续烧下半部分。5. 放凉5秒，不要把接种环放在试验台上避免被污染。6. 大肠杆杆菌的一种划板技术 从培养平板开始：a 用另一只手移动培养有E。Coli

3、的平板的盖子，不要将盖子放在试验台上，盖子面朝下对着培养平板，防止污染物落入平板中。b把接种环在平板干净的地方刺几下使其冷却。C 用接种环刮取一个可见的菌团作为一个克隆，不要刮烂琼脂层。更换一个新的培养皿盖，按照步骤7进行。7. 选一个LB-PAMP平板，打开盖子一点一点，只要足够划线就可以。 划线1：划动接种环的前端向琼脂层表面划线。并使划线遍及平板的顶部，避免划烂琼脂层。 划线2：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离第一次的划线。接种环通过第一次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其约占整个平板表面的1/4. 划线3：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离前两次次的

4、划线。接种环通过第二次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其约占整个平板表面的1/4，且锯状线不要再接触到前面划的线。划线4：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离前三次的划线。接种环通过第三次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其仍然能占到整个平板表面的1/4。8. 重复4-7的过程，把E.coli接种到平板LB/amp，-PAMP（氨苄阴性）。9. 重复4-7的过程，把E.coli/PAMP接种到平板LB，+PAMP（氨苄阴性）。10. 重复4-7的过程，把E.coli/PAMP接种到平板LB/amp，+PAMP（氨苄阴性）。11. 重新烧接种环，并使它冰凉后放在接种工作台上，最后一次使用要烧接种环，保持这个好习惯。12. 把平板颠倒放在37培养箱中，培养15-20h。（平板倒过来放是为了防止凝结产生的水掉落在琼脂层上引起菌板