TALEN靶向基因操作技术

1、talen靶向基因操作技术技术介绍：tale 技术（ transcriptionactivatorlikeeffectors）是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自植物细菌xanthomonassp. 的 tal 蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用tal 的序列模块，可组装成特异结合任意dna序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。目前tale 技术主要有两种应用：1 ） talen（transcriptionactivator-like (tal) effector nucleases）技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的

2、位点打断目标基因dna，进而在该位点进行dna操作，如knock-out 、knock-in或点突变。它克服了常规的zfn方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有zfn相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。2 ） talea（transcription activator-like (tal) effector activator）技术，针对基因启动子上游任意特定dna序列构建转录激活因子，可提高特异内源基因的表达水平，而不需要购买或克隆cdna。tale 技术已经成功应用到了细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能强大的实验

3、室工具，使得过去无法逾越的项目成为可能。技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。2.tal 的核酸识别单元与a、g、c、t 有恒定的对应关系。实验设计简单准确、实验周期短、成本低。3. 成功率几乎可达 100%。4. 毒性低、脱靶情况少。5. 克服了常规的 zfn方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有 zfn相等或更好的活性。tale构建与应用：1.tale 靶点识别模块构建tal 的核酸识别单位为重复34 个恒定氨基酸序列，其中的12、 13 位点双连氨基酸与 a、g、c、t 有恒定的对应关系，即ng识别 t，hd识别 c，ni 识别 a，nn识别

4、g。为获得识别某一特定核酸序列的tale，只须按照 dna序列将相应 tal单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同，选择的特异序列长度也不同，对于哺乳类动物包括人类，一般选取16-20bp 的 dna序列作为识别靶点。2.talen 的基因敲除将识别特异 dna序列的 tale与内切核酸酶foki 偶联 , 可构建成剪切特异dna序列的内切酶 talen。而且 foki 需形成 2 聚体方能发挥活性， 大大减少了随意剪切的几率。 在实际操作中， 需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22 碱基）的靶序列（一般16-20 个碱基）分别进行tal识别模块构建。将这

5、两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到foki 的 n-末端，形成真核表达载体，得到talen质粒对 。将 talen质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。 talen质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白， 分别与靶位点特异结合， 由于两个 talen融合蛋白中的foki 临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性， 在两个靶位点之间剪切dna，形成 dsb（double-strandbreaks ）, 诱发 dna损伤修复机制。细胞可以通过 nhej（non-homologousendjoining ）修复 dna，在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体

6、。3.talen 的同源重组当通过 talen产生 dsb后，若能提供同源修复模板，细胞可通过同源重组方式修复 dna，因此可以对内源dna做更精细的操作， 如点突变（磷酸化位点） 、保守区域替换、 n端或 c端加标记（ gfp、ha、flag ）等等。通过talen产生dsb后，在外源模板存在的情况下，发生同源重组修复dna4.talea 的转录激活将识别特异 dna序列的 tale与转录因子激活区域vp64(vp64activationdomain)融合，可构建成识别启动子上特异 dna序列的转录激活因子 talea。在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列（一般 12-18 个碱

7、基），构建 tal 识别模块。将识别模块 tale融合克隆到 vp64的 n-末端，形成真核表达质粒 talea。将 talen质粒转入细胞中，表达的融合蛋白结合启动子附近的特异 dna序列，并通过 vp64激活区域与 polii结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。为什么选择我们：1. 特有纳米打印自组装 talen技术（已申报 pct专利）使得我们构建talen(a)时间大大缩短， 成本极大降低 。我们的方法比市场现有方法快一倍，而且成本降低一倍。2. 业内顶尖的技术支持团队。我们专业人员具备深厚细胞分子生物学技术、多年的模式生物重组经验，加上一流的服务理念，能百分之百满足客

8、户的需求。除付费服务外，对于意义重大的项目，可以采取各种合作方式，尽快先开展客户的课题， 以充分保证客户项目的进展。我们的团队既有留学美国顶级学校的的高级科学家，他们曾就职美国多家著名医药公司的首席科学家职位, 也有毕业于国内顶级院校的的研究人员。因此，我们能随时与客户进行深入沟通，帮助客户分析研究难题，并提供最优解决方案，从而满足各种实验研究需求。3. 灵活的合作（运营）模式 。可以通过合作共享成果的模式，尽快开展客户的课题。成功案例：本公司自提供talen技术服务以来，已累计成功构建了1000 多对已验证活性的talen质粒，得到了客户的广泛认可，其中比较有代表性的成功案例有：1 、中科院

9、动物所客户在成纤维细胞中，分别成功构建三个基因敲除的细胞系，效率在10-20%（其中一个基因的双链敲除效率达到20%）。2 、北京大学客户从服务开始的两个月时间内，拿到6 个 knock-in细胞系。3 、西南家蚕实验室从本公司提供服务开始，不到3 个月时间拿到基因敲除的家蚕突变体。4 、台湾中原大学使用本公司提供的质粒陆续成功构建了5 种基因敲除的斑马鱼。5 、香港科技大学使用本公司提供的质粒成功构建了6 种基因敲除的斑马鱼。、 ( 持续增加中 )新一代 e-talen：本公司研究人员经过大量的实验工作，对 talen结构进行持续优化，现在成功改造了talen结构，现推出新一代e-talen

10、（enhanced talen), 活性更好，效率更高！图 1talen、e-talen ssa检测信号活性对比图 2 分别转染 talen、 e-talen后，细胞基因组 pcr产物 t7e1 酶切结果对比实验表明， e-talen 比起 talen活性更好，对基因组dna具有更高的剪切效率，使用e-talen将会大大提高实验者后续实验操作的效率。talen服务流程talen技术服务内容服务内容说明周期价格talen质粒组装套餐针对同一目标基因设计合成10 工作询3 对测序正确的 talen质粒。日价根据 dna序列组装 talen质粒，用于细胞内dna切断。talen组装10 工作询价日提

11、供一个或多个质粒和测序结果。检测构建好的 talen质粒活性（报告基因方法或细胞10 工作talen活性检测询价日系内直接检测）通过 talen切断和修复基因编码区第一个外显子，细胞系 talen100%6敲除基因，提供两个目标基因敲除的细胞系（包括基因询价基因敲除周敲除后测序结果）。通过 talen进行 dna切断和同源重组，提供两个目标细胞系 talen同源重基因变异的细胞系。基因变异包括内源基因点突变8询价组（磷酸化位点、保守区域替换），n 端或 c端标记周（gfp、ha、flag ）提供含有 70 多个络氨酸激酶的talen基因文库，也可即talen基因文库询价单个基因购买。时根据基因启动子dna序列组装 talea，提高内源基因10 工作talea组装询价的表达水平。提供一个或多个质粒和测序结果。日talea活性检测检测构建好的 talea质粒活性10 工作询价日提供含有 70 多个络氨酸激酶的