CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介

1、,基因编辑技术crispr/cas9,1987年，日本大阪大学（osaka university） 在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的dna片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。 2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列crispr(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).,2013年之后，研究者们在science 和nature等国际著名杂志上发表多篇文章介绍crispr/cas9系统，并且已成功在人类、

2、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。,1.crispr/cas系统概述,已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在crispr基因座。,根据cas 基因核心元件序列的不用，crispr/cas 免疫体统分为3中类型：型、型和型。型和型crispr/cas免疫系统需要多个cas蛋白形成复合体切割dna双链，而型crispr/cas9免疫系统只需要一个cas9蛋白来切割dna双链，目前型系统是被改造的最成功的人工核酸内切酶。,1.crispr/cas系统概述,1.1crispr的分布与分类：,crispr/cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系统，通过对入侵的病

3、毒和核酸进行特异性的识别，利用cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。,1.2crispr系统获得：,1.crispr/cas系统概述,2.crispr/cas系统结构,2.1crispr/cas 主要由两部分组成：,2.2crispr结构：,crispr是一种特殊的dna 重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。crispr位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21-48bp，重复序列之间被26-72bp间隔序列(spacer)隔开。cirspr通过这些间隔序列(spacer)与靶基因进行识别。,2.crispr/cas系统结构,2.3cas家族

4、：,cas(crispr associated)存在于crispr位点附近，是一种双链dna核酸酶，能在guide rna 引导下对靶位点进行切割。它与foki酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2.crispr/cas系统结构,crispr基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）,当该噬菌体再次入侵细菌时，crispr簇首先转录为长的crrna前体，然后逐步加工成小的成熟的crrna.,crispr/cas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰,crrna结合相关的cas蛋白后，形成crrna-cas蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标dna相结合，随后cas蛋白对目标dn

5、a 进行断裂和降解。,3.crispr/cas9系统作用机制,4.crispr/cas9系统,type 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具-crispr/cas9。现在广泛使用的crispr/cas9系统来源于酿脓链球菌。,type ii系统具有以下特点：,在crispr/cas基因座上游会表达tracrrna;,tracrrna会参与crrna的加工，这个工程亦需要rnaseiii的参与；,tracrrna会与crrna形成二聚体指导cas对双链dna的切割。,cas9是一种核酸内切酶,其具有：ruvc和hnh两个内切酶活性中心,jinek等发现cas9在细菌和试管里对双链dn

6、a具有强烈的切割能力,但是这种切割能力需要的crrna和tracrrna介导。,4.crispr/cas9系统,jinek等创造性的把crrna和部分tracrrna融合成一条嵌合的rna链,使其同时具有crrna和tracrrna的特性,随后的切割实验表明,这条嵌合的rna同样可以引导cas9切割目标dna。现在普遍使用的都是crrna和全长tracrrna 融合体,简称 sgrna (single guide rna),4.crispr/cas9系统,4.crispr/cas9系统,酿脓链球菌,4.crispr/cas9系统,crispr design tool: http:/crispr

7、./,e-crispr: ,zifit: /,cas9 design: http:/cas9 ,cas-offinder: ,cctop: http:/crispr.cos.uni-heidelberg.de/,4.crispr/cas9系统,grna 在线设计工具：,4.crispr/cas9系统,基因敲除或者敲入；,基因修复；,基因调控；,文库筛选。,4.crispr/cas9系统,crispr/cas 作用：,5.crispr/cas9 脱靶效应,2013年，研究者们发表多篇文章介绍c

8、rispr/cas9系统，但crispr/cas9目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消除。,crispr/cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于grna与靠近pam处10-12bp碱基的配对，而其余远离pam处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大。,cas9蛋白不具特异性,沈彬，2015,6.降低脱靶效应,cas9切口酶,通过点突变的方法，使cas9只有单链切割活性，类似于切口酶,yu hisano et al.2014,6.降低脱靶效应,添加同源臂(homology arm,hr),nicolas wyvekens et al.2015,foki-dcas9,6.降低脱靶效应,feng zhang et al. 2015,6.降低脱靶效应,crispr/cpf1系统,cpf1系统更简单一些，它只需要一条rna。cpf1酶也比标准spcas9要小，使得它更易于传送至细胞和组织内。,cpf1以一种不同于cas9的方式切割dna。 cas9切割留下“平端”（blunt ends）。,cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了短悬端（overhang）。这预计有助于精确插入。,cpf1切口远离