实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定免疫球蛋白

1、实验二 SDS-PAGE分离鉴定免疫球蛋白,一、目的,1、了解和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理； 2、掌握用此法分离鉴定纯化蛋白质的操作方法。,二、原理,1 电泳技术基本原理 电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。,聚丙烯酰胺凝胶,SDS 是一种阴离子表面活性剂.它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低甚到消除。与些同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产

2、生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。,SDS-PAGE,四肽链结构 所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链（H）和两条轻链（L）。,三、试剂与器材,1、30%的丙烯酰胺,2、10%SDS 3、TEMED,4、10%过硫酸铵,5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液,6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）,6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.,7、分离胶缓冲

3、液（PH8.8）,36.3g Tris,48ml 1mol/L HCl, 加水至100ml.,8、5xSDS凝胶上样缓冲液,四、实验步骤：,1、聚丙烯酰胺凝胶的制备,根据目的蛋白质的相对分子质量大小确定凝胶使用浓度，浓缩胶一般为3%5%,分离胶浓度与蛋白质分子质量的关系,1、配制10ML12%分离胶,2、装配好电泳用双层垂直玻璃板，保证底部不漏水。将混合均匀的 分离胶凝胶溶液灌入双层玻璃板之间，控制溶液高度距离矮玻璃 板上缘23cm，立即在凝胶顶部加入23cm水层，室温静止 3060min，待凝胶凝固后吸去顶部水层，灌浓缩胶至 双层玻璃板灌满为止，立即插入梳子，静止3060min， 待凝胶凝固

4、。,电泳槽,3、浓缩胶的制备,聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的液体，尽可能用滤纸吸干凝胶顶层的残存液体。按下列配方制备浓缩胶，混匀后将浓缩胶灌入分离胶的上面，插入梳子，小心避免气泡的出现。,3、蛋白质样品的制备,样品中加入上样缓冲液，在沸水浴中煮沸35min， 500010000g离心35min，上清液备用。,4、点样,将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液， 拨除梳子。用微量移液器点样。,5、电泳,样品在浓缩胶时，低电压（6080V，起始电流不超过1015mA）， 进入分离胶后，提高电压（100200V，电流不超过30mA），当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶12mm，终止电泳。最好在低温下进行

5、。,6、染色与脱色,电泳结束后，剥下凝胶，将凝胶置于染色液中， 根据目标条带颜色深浅确定染色时间，一般为 室温下3060min，染色后，倒掉染色液，换 脱色液，在摇床上振摇12h左右，中间需换脱 色液，直到看清目的条带为止。,7、用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析,图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱,实验结果分析,94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400,胶槽1,2,3,注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白,实验注意事项,1丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤，呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。注意不能随便倾倒单体溶液，应加入过量的催化剂使其完全聚合

6、成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。 2.形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量。,3. 过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。 4 蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。,（1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。,电泳过程中的不正常现象,（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的

7、“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。,（3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。,（4）“纹理”现象由于样品中的不溶颗粒引起的。,（5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起,（6）带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起,实验三 目的蛋白Western Blotting检测,一、目的,1、了解Western Blotting的原理及其意义，掌握Western Blotting的操作方法； 2、应用Western Blotting技术鉴定经SDS-PAGE分离后的目标蛋白。,二、原理,Western Blotting简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样

8、品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，即可检测出样品中的特异蛋白质组分。,三、试剂与器材,1、膜转移缓冲液,2、TBST缓冲液,3、封闭液 含有5%脱脂奶粉的TBST液。,4、DAB显色,实验器材,半干转移槽 PVDF (聚偏氟乙烯)膜 两张厚的滤纸 刀片 塑料盒,四、操作步骤,1、当表达产物的SDS-PAGE电泳结束时，带上手套，剥胶，切6-8张滤纸和一张PVDF膜，它们的大小与凝胶

9、完全吻合。 2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min 3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路）提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上，再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺上滤纸并压走多余液体。,4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM） 半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入5%脱脂奶粉4封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每