粮食中伏马毒素含量测定方法免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光计法国家标准编制说明送审稿

1、粮食中伏马毒素含量测定方法-免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光计法国家标准编制说明（送审稿）粮食中伏马毒素的测定国家标准编制小组2008年6月20日1工作简况（包括任务来源、协作单位、主要工作过程、国家标准主要起草人及其所做的工作等）1.1 任务来源及协作单位根据国标委计200785号文件，关于下达2007年第四批国家标准制修订计划的通知附件“2007年第四批国家标准制修订计划”第828项粮食中伏马毒素含量测定方法-免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光计法（编号20071601-t-449）的任务要求，制定本标准。本标准由全国粮油标准化技术委员会归口，由国家粮食局标准质量中心、国家粮食局科学研究

2、院共同起草制定。 1.2 主要工作过程本标准制修订计划下达后，即组织开始了该标准的制订工作。2008年3月14日，根据全国粮油标准化技术委员会粮食及制品技术工作组和国家粮食局标准质量中心的要求，在“2008年国家标准制修订技术讨论会”对本标准的制订进展做了汇报。4月份，结合前期工作，基本完成了本标准的实验和起草工作，编制了粮食中伏马毒素含量测定方法-免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光计法（草案稿）。5月份，编制小组经过反复讨论，并依据国家标准编制的有关要求对草案稿做了进一步的完善，并于6月底完成了粮食中伏马毒素含量测定方法-免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光计法（征求意见稿）和编制说明。7月初

3、，开始在有关单位进行验证工作，同期开展了向全国各有关单位和专家发放征求意见稿，开始意见征求，在8月底完成意见征求工作。2008年9月初参与了全国粮油标准化技术委员会粮食及制品技术工作组的预审，并根据专家意见进行了修改。2. 国家标准编制原则和确定国家标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、实验方法、检验规则等）的论据（包括实验、统计数据），修订国家标准时，应增列新旧国家标准水平的对比 2.1 编制原则 本标准的编制原则遵循以下内容：1、要适应我国市场经济和粮食流通体制改革的总体要求，满足我国加入世界贸易组织的需要。2、积极采用或吸收转化国际标准，逐步完成与国际接轨。3、要有利于提高粮食

4、及其制品卫生质量，促进粮食流通安全，为食品安全检测部门、有关企业和“三农”服务。2.2 确定国家标准主要内容的依据传统的伏马毒素分析一般采用薄层色谱法（tlc）和酶联吸附免疫法（elisa）。tlc虽然简便，但重复性差。elisa重复性差、试剂寿命短需要低温保存。此外，这些方法都具有如下共同的不足之处：（1）在操作过程中，需要使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物，对操作人员造成巨大的沾污危险。（2）在对样品进行预处理过程中，需要使用多种有毒、异味的有机溶剂，不仅毒害操作人员，而且污染环境。（3）操作过程烦琐、时间长，劳动强度大。采用免疫亲和柱净化，用荧光光度计和高效液相色谱测定粮食中的伏马毒素是目

5、前国际普遍采用的先进分析方法。它的特点如下：（1）采用单克隆抗体免疫技术，可以特效性地将伏马毒素分离出来，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强。（2）分析速度快，一个样品只需15-20分钟，而其它传统方法均需要几个小时至几天时间。（3）灵敏度高，测定范围宽。（4）荧光光度计轻便容易携带，自动化程度高，操作简单，直接读出测试结果，高中文化水平者即可胜任，可以在小型实验室或现场使用。（5）荧光光度法一经标定不需要剧毒的伏马菌素标准物再来标定，所以整个试验操作过程中，安全可靠。 (6）采用免疫亲和柱净化技术作为真菌毒素测定的前处理方法已被列入许多国际标准方法中，如国际职业分析化学家协会（aoac）制

6、订的“玉米和玉米片中伏马毒素b1和b2的测定-免疫亲和柱净化高效液相色谱法” aoac fumonisins b1 and b2 in corn and corn flakes (2001.04)和美国农业部谷物检测、包装、贮存行政署（usda-gipsa）认证的官方方法-免疫亲和柱净化荧光光度计快速测定粮食中的伏马毒素。因此，有必要尽快制定粮食中伏马毒素含量测定方法-免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光计法国家标准，以满足我国检测机构的需要并与国际接轨。基于上述，确定了本标准的主要内容为用免疫亲和柱净化高效液相色谱法和免疫亲和柱净化荧光光度法测定粮食中伏马毒素。同时，在结构方面，本标准的结构、

7、技术要素及表述方法按照gb/t 1.1-2000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则以及gb/t 20001.4-2001标准编写规则第4部分：化学分析方法规定的要求进行了编写。3主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果 伏马毒素是1989年发现的一种新型毒素，由串珠镰刀菌（fusarium moniliforme）、轮状镰刀菌(f. verticillioides)、多育镰刀菌(fproliferatum)等产生的真菌毒素。尖孢镰刀菌(foxysporum)、f. nygami等菌珠也能产生伏马菌素。伏马毒素b1和b2在自然界存在最普遍，且毒性最强，可导致马

8、产生白脑软化症（elem），神经性中毒而呈现意识障碍、失明和运动失调，甚至造成死亡；对猪产生肺水肿综合症（ppe），并被怀疑可诱发人类的食道癌等疾病，从而对畜牧业及人类的健康构成威胁。对我国海门地区进行的3年的跟踪研究结果表明：伏马菌素还可使人导致肝癌。国际癌症研究机构iarc 1993年将其归类为2b类致癌物。据资料报道，伏马毒素大多存在于玉米及玉米制品中，其含量一般超过1mg/kg，研究证实，在大米、面条、调味品、高粱、啤酒中也有较低浓度的伏马毒素存在。2000年美国fda推荐人类食品中玉米面及其制品中伏马菌素的含量不得超过2mg/kg。我国粮食中伏马毒素的限量标准正在制订中。1、 方法的

9、建立本标准在制订时，参照了aoac fumonisins b1 and b2 in corn and corn flakes (2001.04) “玉米和玉米片中伏马毒素b1和b2的测定-免疫亲和柱净化高效液相色谱法”和fgis（美国联邦谷物检验局）的伏马毒素测试方法（fgis 2003-102 quantitative test kit for fumonisin for corn, corn meal, corn soy blend, corn germ meal, sorghum, popcorn, and flaking corn grits）。一、高效液相色谱方法1）提取溶剂的选择：

10、报道的玉米中伏马毒素的提取溶剂多采用甲醇水溶液和乙腈水溶液，如甲醇：水（80/20，v/v）1、甲醇：水（70/30，v/v）2、乙腈：0.1 mol/ml 磷酸二氢钠（1：1，v/v）3等。欧盟对比研究表明，振荡提取方法在提取玉米中伏马毒素的效果较好，同时考虑到自然污染样品中的伏马毒素比添加样品的伏马毒素难以提取4。本方法在制订时参考了aoac fumonisins b1 and b2 in corn and corn flakes (2001.04) “玉米和玉米片中伏马毒素b1和b2的测定-免疫亲和柱净化高效液相色谱法”的提取溶液和提取方法，即选择乙腈：甲醇：水复合提取溶液，采用两步振荡

11、提取方法。具体操作如下：准确称取经过粉碎(粒度小于2 mm)的20.0 g (精确到1mg )玉米或者玉米制品置于250 ml的离心管中，加50 ml提取液。盖好离心管的盖，在水平摇床上震荡20min。在离心力为2500g的离心机上离心10 min，过滤。在过滤后的固体物中再次添加50 ml提取液，在水平摇床上震荡20min，用离心力为2500g的离心机离心10 min，再次过滤，然后将两次的滤液混合。文献5和实验都表明，该提取效果较好。2）稀释：考虑到免疫亲和柱对有机溶剂的耐受性有限，我们对提取后的溶液进行了必要的稀释。通常，采用免疫亲和柱净化，在提取完成后，对提取液的适当稀释是需要的，因为

12、提取液的极性和酸度会影响到免疫亲和柱的选择性吸附效果，本标准采用相对温和的中性磷酸盐缓冲溶液（pbs）对提取样品进行了5倍浓度的稀释。即量取10 ml置于100 ml的容量瓶中，加40mlpbs缓冲液，混匀。用玻璃微纤维滤纸过滤，取10 ml滤液用于亲和柱进行净化。3）免疫亲和柱净化：不同厂家提供的免疫亲和柱的操作步骤有可能不同，但基本程序都是在样品通过柱子后，先用清洗溶液对柱子进行清洗然后再用甲醇或其它洗脱溶剂进行洗脱。在进行洗脱上，洗脱速度要控制好，一般为1滴/秒左右。由于免疫亲和柱都有一定的柱容量，也特别注意样品的浓度不要超过柱子的柱容量，否则需要稀释重做。柱子的容量等参数可向厂家索取。

13、具体操作时，推荐按照亲和柱提供厂商的说明进行操作，有助于获得更好的试验结果。4）衍生化反应和色谱分析：自1990年shephard等首次把邻苯二甲醛（opa）用作伏马菌素hplc测定的柱前荧光衍生剂后，opa至今仍然是大多数实验室中进行hplc荧光检测伏马毒素时普遍使用的柱前衍生剂。由于伏马毒素的opa衍生体系不是很稳定，通常需要在短时间内即进行进样分析。在我们的试验室内，该衍生体系在10分钟中内仍比较稳定，一般建议在衍生3分钟时进样。衍生样品结果色谱系统的分离检测后，会分别先后出现伏马毒素b1-opa和伏马毒素b2-opa两个峰。如果伏马毒素的浓度超过了标准曲线，用乙腈/水（50+50，v/

14、v）将净化提取溶液进一步地稀释后，重新进行衍生化反应和色谱分析。opa衍生试剂要现配现用，不要搁置太久。在一些实验室发现衍生效果并不理想，杂峰较多，基线不平，这可能和opa纯度有一定关系。5) 标准工作曲线和定量检测限：将伏马毒素b1和b2的储备溶液稀释成一系列浓度的工作标准溶液（质量浓度分别为b1:0.25 mg/l、0.50 mg/l、1.0 mg/l、2.0 mg/l、5.0 mg/l，b2: 0.125 mg/l、0.25 mg/l、0.5 mg/l、1.0 mg/l、2.5 mg/l），按上述实验条件，进行分离检测，以所得峰面积y对质量浓度x（mg/l）进行回归分析（见附图1），得回

15、归方程yfb1=38.001x+0.7722，r2=0.9998，yfb2=29.191x+0.6807，r2=0.9987表明线形关系良好。在本实验条件下，将标准溶液连续稀释后进行粮食空白样品的加标回收，根据10倍噪音的峰响应值、取样量和进样量，得出方法的检测限为为0.1 mg/kg。6) 方法的准确度和精密度采用玉米和玉米粉进行添加回收和精密度实验，样品中添加不同浓度的标准溶液，使其含量水平分别为fb1 0.5 mg/kg+fb2 0.25mg/kg，fb1 1.0 mg/kg+fb2 0.50 mg/kg, fb1 5 mg/kg+fb2 2.5mg/kg，充分摇匀，使标准溶液与样品充分

16、吸收，按照本实验方法进行回收率测定，每个添加水平重复测定10次，其回收率和精密度见附表1。从表中数据可以看出，本方法平均回收率数据在77%85%之间，室内三个水平的相对标准偏差在15%以内。伏马毒素b1和b2的标准品色谱图见附图2。玉米空白样品和部分添加样品的对照色谱图见附图3-6。7）方法的验证本方法经中国科学院生态环境研究中心、北京农产品质量检测与农田环境监测技术研究中心、安徽出入境检验检疫局检测室、河南出入境检验检疫局技术中心、山东中粮花生制品有限公司有限公司检验室等5家实验室验证。采用玉米和玉米制品进行3个水平的添加回收和精密度实验，验证结果见附表2。全部数据采用格拉布斯（grubbs

17、）法检验未发现异常值，经统计分析，其室间精密度实验数据均符合要求（参照欧盟指令（commission regulation (ec) no 401/20066）有关对食品中伏马毒素b1和b2的检测方法所提出的检测性能要求）。二、荧光光度计法荧光光度计是一种快速检测玉米及其制品中伏马毒素总量的方法。该方法通过快速萃取和优化净化程序，可在短时间内实现对玉米及其制品中伏马毒素的检测。 1）样品提取：本方法主要参考了fgis（美国联邦谷物检验局）的伏马毒素测试方法（fgis 2003-102 quantitative test kit for fumonisin for corn, corn meal

18、, corn soy blend, corn germ meal, sorghum, popcorn, and flaking corn grits），采用的提取溶液为甲醇/水（80：20，v/v）。该方法测定的是伏马毒素的总量，为了简化提取步骤和减少分析时间，采用的是快速均质提取方法。即称取50g磨细的样品（95%可过20目筛）和5g 氯化钠置于均质杯中。加入100 ml甲醇/水（80：20,v/v）溶液。盖上均质杯的盖子，高速搅拌1分钟（约22000 r/min）。取下盖子，将提取物倒入折叠式滤纸上，滤液收集于干净的容器中。在荧光光度计法中，采用的是快速均质搅拌提取方法，提取溶液为甲醇/水

19、（80：20）溶液。添加回收率试验表明，该提取溶液能够很好的将玉米和玉米制品中的伏马毒素提取出来。2）提取物的稀释：和高效液相色谱方法一样，荧光光度计方法中也对提取物进行了稀释，为下一步过免疫亲和柱子做准备。根据推荐稀释溶液用的是pbs/0.1%tween-20/2.5%peg 清洗缓冲液。3）免疫亲和柱净化：将上步10ml滤液（10ml=1.0g的样品），以1-1.5滴/秒的流速全部通过伏马毒素免疫亲和柱，直至空气进入到亲和柱中。将10 ml pbs/0.1% tween-20/2.5%peg 清洗缓冲液以1-2滴/秒的流速通过亲和柱。将10ml pbs缓冲液以1-2滴/秒的流速通过亲和柱，

20、直至空气进入柱中。用1.0 ml hplc级的甲醇以1 滴/秒的流速淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液（1 ml）收集于玻璃测试管中备测。4）测定：在用荧光光度计测定伏马毒素时，荧光光度计标定是十分重要的一步，也是该方法的主要优点。由于伏马毒素具有较大的毒性，因此少用或者不用伏马毒素标准品就可以直接测定谷物中伏马毒素的含量将是一个比较理想的选择。本方法中通过称取定量的荧光标准物质硫酸奎宁（c40h54n4o10s），用硫酸溶液（0.05 mol/l）稀释至100 ml，分别用3 g/ml和6 g/ml伏马毒素甲醇标准溶液和等体积的opa衍生显色液的衍生液确定相当于该浓度伏马毒素荧光强度的硫酸奎宁的浓

21、度，并用该浓度的硫酸奎宁来标定荧光光度计。此标定溶液浓度一经确定，可在该荧光计上反复使用。在测定时，于激发波长335nm、发射波长440nm条件下，以0.05 mol/l硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0 g/ml。用上述荧光光度计标定溶液调节荧光光度计的读数值为相当的伏马毒素浓度，即可进行样品的定量测定。5）衍生和定量：取上述opa衍生显色液1 ml加到测试管的1ml的甲醇淋洗液中。混匀后，将测试管置于已标定好了的荧光计中。240秒后，读数。6）方法的准确度、精密度和检测限：采用玉米和玉米制品进行添加回收和精密度实验，样品中添加不同浓度的标准溶液，使其含量水平分别为1.0 mg/

22、kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg，充分摇匀，使标准溶液与样品充分吸收，按照本实验方法进行回收率测定，每个添加水平重复测定6次，其回收率和精密度见附表3。从表中数据可以看出，本方法平均回收率数据在74%81%之间，室内三个水平的相对标准偏差在15%以内。在本实验条件下，将标准溶液连续稀释后进行粮食空白样品的加标回收，确定该方法的检测限为小于0.5 mg/kg。7）方法的验证：本方法经青岛捷安信检验技术服务有限公司、重庆出入境检验检疫局技术中心、北京出入境检验检疫局技术中心、安徽出入境检验检疫局检测室、河南出入境检验检疫局技术中心、山东中粮花生制品有限公司有限公司检验室等6家实验室验

23、证。采用玉米和玉米制品进行3个水平的添加回收和精密度实验，验证结果见附表4。全部数据采用格拉布斯（grubbs）法检验未发现异常值，经统计分析，其室间精密度实验数据均符合要求（参照欧盟指令（commission regulation (ec) no 401/20066）有关对食品中伏马毒素的检测方法所提出的检测性能要求）。2、 预期效益霉菌毒素是造成粮食包括饲料污染的主要因素，每年因此所造成的经济损失十分可观，伏马毒素作为污染玉米和其制品的主要真菌毒素，不仅造成了原粮的损失，同时也将这种污染带入了饲料行业，导致畜牧产业也将遭受较大损失。该方法能对玉米和玉米制品中的伏马毒素进行准确和快速的检测，

24、这对预防和控制玉米和玉米制品中的伏马毒素的污染将起到积极的作用，其社会效益和经济效益都十分显著。4 采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况 本标准制订时在技术内容上参照了aoac fumonisins b1 and b2 in corn and corn flakes (2001.04) “玉米和玉米片中伏马毒素b1和b2的测定-免疫亲和柱净化高效液相色谱法”和fgis（美国联邦谷物检验局）的伏马毒素测试方法（fgis 2003-102 quantitative test kit for fumonisin for

25、corn, corn meal, corn soy blend, corn germ meal, sorghum, popcorn, and flaking corn grits）。本国家标准实施后，将与国际和国外先进标准接轨, 达到国际先进水平。5 与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系6重大分歧意见的处理经过和依据根据标准送审稿的征求意见，对标准与本编制说明进行了修改，详细情况见“xxx标准意见汇总表”。7国家标准作为强制性国家标准或推荐性国家标准的建议建议本标准作为推荐性国家标准发布。8贯彻国家标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过度办法等内容）为了贯彻好本标准，使其有效

26、发挥作用，建议在标准发布后，在各个粮油检测中心和有关机构和测试中心进行宣传与贯彻，并组织有关部门成员进行学习和培训。9废止现行有关标准的建议无10、其它应予说明的事项无参考文献1、paepens c. et al. 2004. a flow-through enzyme immunoassay for the screening of fumonisins in maize analytica chimica acta 523, 229-2352、abbas, h.k. et al. 2002. aflatoxin and fumonisin contamination of commerci

27、al corn (zea mays) hybrids in mississippi. j. agric. food chem. 50, 52465254.3、林维宣,裴轶君,董伟峰.固相萃取-高效液相色谱法测定玉米中伏马毒素b1j.大连轻工业学院学报, 2004,23(1):1517.4、shephard gs 1998 chromatographic determination of fumonisin mycotoxins journal of chromatography a, 815,31-395、visconit a et al. 2001 determination of fumo

28、nisins b1 and b2 in corn and corn flakes by liquid chromatography with immunoaffinity column cleanup: collaborative study journal of aoac international 84(6):1828-18376、commission regulation (ec) no 401/2006: laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of

29、mycotoxins in foodstuffs. official journal of the european union 9.3.2006附件附图1、伏马毒素b1和b2的标准工作曲线 附图2、伏马毒素b1和b2的标准品色谱图附图3、玉米空白样品附图4、玉米添加样品 0.5 mg/kg fb1+ 0.25 mg/kg fb2附图5、玉米添加样品 1 mg/kg fb1+ 0. 5 mg/kg fb2附图6、玉米添加样品 5 mg/kg fb1+ 2. 5 mg/kg fb2附表1、 伏马毒素hplc方法实验室室内实验数据（n=10）玉 米玉米制品fb1fb2fb1fb2fb1fb2fb1

30、fb2fb1fb2fb1fb20.50.2510.552.50.50.2510.552.5mg/kgmg/kg mg/kgmg/kgmg/kgmg/kgmg/kgmg/kg mg/kgmg/kgmg/kgmg/kg10.81 0.89 0.75 0.83 0.92 0.88 0.78 0.90 0.74 0.94 0.85 0.78 20.72 0.84 0.75 0.87 0.84 0.76 0.74 0.89 0.72 0.87 0.76 0.84 30.78 0.72 0.72 0.78 0.82 0.80 0.77 0.78 0.81 0.80 0.66 0.72 40.83 0.84

31、 0.87 0.76 0.80 0.88 0.76 0.83 0.78 0.69 0.87 0.76 50.75 0.85 0.88 0.80 0.84 0.83 0.72 0.68 0.79 0.74 0.83 0.78 60.81 0.83 0.92 0.88 0.80 0.78 0.87 0.78 0.87 0.79 0.98 0.79 70.92 0.79 0.85 0.84 0.78 0.79 0.88 0.95 0.78 0.87 1.01 0.71 80.97 0.88 0.86 0.84 0.78 0.72 0.82 0.88 0.66 0.73 0.84 0.83 90.73

32、 0.91 0.70 0.68 0.76 0.79 0.80 0.78 0.88 0.82 0.78 0.76 100.95 0.78 0.66 0.66 0.83 0.85 0.91 0.81 0.87 0.74 0.91 0.68 x0.830.830.800.790.820.810.810.830.790.800.850.77s0.090 0.057 0.090 0.075 0.045 0.052 0.064 0.079 0.071 0.078 0.103 0.051 c.v（%）10.9 6.9 11.3 9.4 5.5 6.4 7.9 9.6 9.0 9.7 12.2 6.6 附表2

33、、 伏马毒素hplc方法实验室室间实验数据（n=5）玉 米玉米制品fb1fb2fb1fb2fb1fb2fb1fb2fb1fb2fb1fb20.50.2510.552.50.50.2510.552.5mg/kgmg/kg mg/kgmg/kgmg/kgmg/kgmg/kgmg/kg mg/kgmg/kgmg/kgmg/kga0.72 1.16 0.73 0.74 0.98 0.84 0.74 0.64 0.85 0.76 1.13 0.93 0.90 0.80 0.85 0.96 0.68 0.76 0.66 0.84 0.72 0.90 0.82 0.78 0.70 0.72 0.72 0.7

34、0 0.84 0.77 0.84 0.72 0.80 0.84 0.93 0.70 b0.68 0.72 0.82 0.78 0.84 0.66 0.94 1.12 0.71 0.88 0.73 0.71 0.84 0.88 0.73 0.64 0.65 0.78 0.74 0.72 0.76 0.76 0.77 0.82 0.74 0.64 0.75 0.70 0.78 0.69 0.72 0.92 0.81 0.70 0.94 0.68 c0.74 0.68 1.09 0.76 0.88 0.67 0.76 0.88 0.73 0.86 0.72 0.92 0.96 0.88 0.73 1

35、.04 0.72 0.93 0.92 0.64 0.85 0.68 0.78 0.72 0.64 0.72 0.78 0.86 0.70 0.69 0.68 0.76 0.71 0.76 0.94 0.72 d0.87 0.73 0.82 0.88 1.00 0.77 0.76 0.92 0.94 0.75 1.02 1.05 0.85 0.78 0.83 0.91 1.00 0.72 0.73 0.89 0.95 0.73 1.00 1.03 0.91 0.72 0.80 0.92 1.01 0.74 0.72 0.99 0.93 0.70 1.02 0.99 e0.82 0.73 0.81 0.85 0.89 0.81 0.94 0.69 1.08 0.78 0.88 0.84 0.87 0.82 0.79 0.86 0.90 0.86 0.