紫外-可见分光度法UV.ppt

1、第三章 紫外可见分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry; UV-vis ）,研究物质在紫外-可见光区分子吸收光谱的分析方法。（近紫外光区 200-400nm，可见光区400-760nm）,A,分光：将复合光变成单色光叫分光,可见光（400-760nm）,红橙黄绿青蓝紫,红外,紫外,610-780,400-435,分光系统,特点：灵敏度高（10-6g/ml），简单方便。,应用：1、定性分析 2、定量分析,发展趋势：与计算机联用及某些数学联用（如导数光谱）,紫外光谱主要产生于分子价电子在电子能级间的跃迁，属于电子光谱,图3-1 分子能级跃迁示

2、意图 V. 振动能级 J. 转动能级,（一）光谱的产生,E= E内+E平+E振+E转+E电子 E内是分子固有的内能，E平是连续变化的，不具有量子化特征,故 E=E振+E转+E电子,其中E电子最大，一般为1eV20eV，(1250nm60nm)。由外层电子跃迁而产生的光谱位于紫外-可见光区,（一）光谱的产生,1基本原理,分子能级跃迁示意图 V. 振动能级 J. 转动能级,（二）电子跃迁：,有机化合物分子中主要含有的价电子类型: 形成单键的电子；形成双键或叁键的电子及未成键的n电子(亦称p电子)。 各分子轨道能级高低顺序是： n* 、表示成键分子轨道，n表示未成键分子轨道（亦称非键轨道），*、*表

3、示反键分子轨道。,在紫外-可见光区内，有机化合物的吸收光谱主要由*、*、n*及n*跃迁产生。,不同类型电子跃迁能量与波段示意图,分子吸收何种光（）与能级差（E）有关 吸收强度大小（）则与跃迁机率有关,同型轨道之间跃迁几率大。,E,I0,I,*跃迁：,特点: 能级间隔E大，max小，一般 max 150nm，远紫外吸收。,（2） *跃迁： E 小 a 单个键， max =200nm，末端吸收 b 共轭键， max =210-250nm，104。,200nm,A,末端吸收,具有CC或CC、CN等基团的不饱和有机化合物都会产生*跃迁,（3） n*跃迁,含有杂原子的不饱和基团，如CO、CS、NN等化合

4、物，其未成键轨道中的n电子吸收能量后，向*反键轨道跃迁,E更小， max 250nm， =10-100。,丙酮的max279nm,(4) n*跃迁,含OH、NH2、X、S等基团的化合物，其n电子吸收能量后向*反键轨道跃迁,max =200nm，末端吸收。,二常用术语,吸收曲线(吸收光谱): 以波长（nm）为横坐标，以吸光度A为纵坐标所描绘的曲线。,吸收峰：曲线上吸收最大的地方，它所对应的波长称最大吸收波长（max）。,谷：峰与峰之间的部位叫谷，该处的波长称最小吸收波长（ min）。,末端吸收：在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分称末端吸收。,A,吸收峰,肩峰（sh）,吸收谷,末端吸收,ma

5、x,min,发（生）色团：是指能在紫外-可见波长范围内产生吸收的原子团，如CC、CO、 CS、NO2、NN等,特点:结构中含有*或n*跃迁的基团,助色团：是指本身不吸收紫外可见光，但与发色团相连时，可使发色团所产生的吸收峰红移并使吸收强度增加的原子或原子团。如OH、OR、NH2、SH、X等 。,红移（长移）：吸收峰向长波方向移动。如助色团、共轭键的影响。,蓝移（短移）：吸收峰（）向短波方向移动。如共轭键减少或溶剂的影响。,浓色效应和淡色效应：使吸收强度（）增加称浓色效应。反之称为淡色效应或减色效应。,强带和弱带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡max大于104的吸收峰称为强带，凡max小于103

6、的吸收峰称为弱带。,三吸收带,紫外-可见光谱为带状光谱，紫外-可见光谱中吸收峰称为吸收带,R带：由n*跃迁引起的吸收带。如CO、NO、NO2、NN等,特点 ：（1）max250nm,（2） 100，为弱吸收,（3） 溶剂的极性越大， max越小,例,当有强吸收峰在其附近时，R带有时红移，有时被掩盖,K带：由共轭双键中*跃迁所产生的吸收峰。 如 1,3-丁二烯。,特点 ：（1） max=210-250nm,（2） 104，为强吸收,（3） 溶剂的极性越大， max越大,- *跃迁，K带,*跃迁，K带 n*跃迁， R带,，,，,200nm,300nm,A,K带,R带,B带：苯环骨架振动和环内共轭*

7、重叠所致，是芳香族化合物的特征吸收带。,特点: (1)在非极性的溶剂中，B带230-270nm产生细微振动,（2）在极性的溶剂中，细微结构消失，重心在256nm附近，在200左右。,（3）被取代时，细微结构消失,（4）B带是有机化合物的特征谱带,蒸气,在环已烷中,在水中,240nm,260nm,256nm,E带：由苯环结构中三个乙烯的*所产生，分为E1和E2带。是苯环的特征吸收谱带。,E1带：180nm，6104 。,E2带：=200nm 8103 。,例：,B带 max 增大，282nm,E2带与K带合并，移至210-250nm,B R K,当苯环上有发色团取代并共轭时，E2带与K带合并，吸

8、收带长移，且使B带长移。,log,10,300,200,100,500,400,700,600,800,1,2,3,4,5,远紫外区,近紫外区,可见光区,*,*,*,n,n,波长(nm),几种常见的紫外与可见吸收光谱,*,n,R带,K带,R带,运用：预测一个化合物的吸收带可能出现的范围及吸收带的类型。,R带（250-500nm）,*,n,共轭 K带（210-250nm）, *,影响吸收带的因素,1.位阻影响 立体空间结构影响共轭效应。,顺式二苯乙烯,反式二苯乙烯,同分异构体：,2.跨环效应,3.溶剂效应：除了影响吸收峰（）位置外，还影响吸收强度（）和光谱形状。,溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸

9、收峰的影响,跃迁类型 正已烷 氯仿 甲醇 水 迁移, - * 230 238 237 243 长移,n - * 329 315 309 305 短移,4.体系pH值的影响：主要是对弱酸弱碱性物质的影响。,非极性溶剂,极性溶剂,非极性溶剂,极性溶剂,n*跃迁,*跃迁,2 Lambert-Beer定律,一.参数,1.入射光的强度I0,I0,b,2.透射光的强度It,It,3.透光率 TIt/I0 百分透光率TI/I0 100,4.比色池厚度：b,5.样品浓度：C（mol/l，）,6.吸光度：AlgT=lg(I0/It),二.Lambert-Beer定律,Lambert定律：C一定，A-lgT=K1

10、b,Beer定律：b一定，A-lgT=K2c,两定律合并：Aabc a=K1K2 a为吸收系数,注：吸光度A是指某一波长（）下的吸光强度即入射光为单色光,吸收系数：,摩尔吸收系数()：在一定条件下，当C1mol/l，b=1cm时的吸光度。,百分吸收系数（ ）：一定条件下，当C1，b=1cm时的吸光度。,特征： 1）、E均为特征常数 2）、E是有条件的，同一物质，不同条件下所测值不同（波长不同、溶剂不同、温度不同等）。 3）、E越大，测定吸光度灵敏度越高。 4）=104-105为强吸收，103-104为中吸收，103为弱吸收。,例：紫草素（C16H6O5 288.3），2.00mg溶于100.0

11、ml乙醇中，b=1cm，max =516nm，A=0.484.求、E,注：若溶液中存在多种吸光物质时，吸光度将是各组分吸光度的总和。,A总Aa+Ab+Ac+ adCa+ bdCb+ cdCc+,I0,a、b、c,I,d,注：每种物质的吸收度仅由本身的性质和C决定，与其它物质无关。,吸光度A具有加和性，对同一物质来说,线性范围：线性范围越大越好。,三、偏离Beer定律的因素,1)化学因素：离解、缔合、配位等化学 变化，使吸光物质形态发生变化。溶剂、pH、温度等影响。,Aabc,影响吸收系数a的因素有：,1、物质的性质,2、测定波长,3、其它因素 如溶剂的影响等, 104,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收

12、光谱,a,b,c,(a)6.3610-6mol/l,(b)1.2710-4mol/l,(c)5.9710-4mol/l,610nm,660nm,2、光学因素,（1）单色光的纯度,Beer定律前提：入射光是单色光。,单色光,I0,I,单色器,复合光,狭缝,I0,比色池,760nm,400nm,可见光,单色光的谱带宽 s=2-1,510-520,谱带宽度的值愈小，单色性愈好。,（2）杂散光:与所需波长相隔较远的光。,（4）非平行光,（3）散射、反射,克服方法：,比色池：擦干净 溶液：溶液均一，透明；用空白作参比。,克服方法：比色池位置放正确，与光路垂直。,三、透光率测量误差,透光率测量误差（T），

13、来自仪器的噪声。,C与T和T有关,不同T%或A时的浓度相对误差,结论：当A值在0.2-0.7，相对误差较小，是测量最适宜范围。,3显色反应及其显色条件的选择,能吸收紫外光的物质可用紫外光度法直接测定，无色或颜色浅的物质，通常选用显色反应来测定。,显色反应:选用适当的试剂与被测物质定量反应生成有色的物质再进行测定的分析方法。显色反应中所用的试剂称为显色剂。,Fe2+与邻二氮菲能生成稳定的红色配合物max=510nm(11000)，可用此反应测定定微量铁,一、显色反应的选择,一般为配位反应、氧化还原反应、缩合反应,要求：,1、定量关系明确 2、灵敏度高 3、产物稳定性好 4、显色剂无干扰（一般相关

14、60nm以上） 5、选择性好,二、显色条件的选择,提高反应灵敏度、选择性、稳定性,1、显色剂的用量,通常需要加入过量的显色剂,2、溶液酸度,影响显色剂存在形式和显色产物的浓度,3、显色时间,注：确定实验方法要考察稳定性。,4、 显色温度：显色反应结果与温度有关。,5、溶剂,苦味酸在水溶液中呈黄色，而在氯仿中呈无色,显色反应产物的稳定性也与溶剂有关,有些物质溶解于不同的溶剂中，会出现不同的颜色,三、 测量条件的选择,干扰物质的影响,干扰物质本身有颜色或无色但与显色剂形成有色化合物，且有吸收 干扰物质水解，析出沉淀使溶液混浊 与待测离子或显色剂形成更稳定的化合物，使显色反应不能进行完全,消除干扰的

15、方法：,1、控制酸度,控制合适的酸度可提高反应的选择性,2、选择适当的掩蔽剂,3、使其生成惰性配合物,4、选择合适的测量波长,选择原则“吸收最大，干扰最小”,测定波长一般选择在被测组分最大吸收波长处，此时A较大，测定灵敏度高,如出现多个max，应选择干扰最小，A较大且平坦处的最大吸收波长,KMnO4的测定一般选择其525nm的max ，如在K2Cr2O7存在下测量KMnO4，则应选择另一最大吸收波长=545nm,5、选择适宜的空白（参比）溶液,吸光度值应只反映被测物质对光的吸收，要扣除其它因素的影响,（溶剂、试剂、器皿、试样都可能引入干扰）,常用的空白溶液：,溶剂空白：用溶剂作为空白溶液 适用

16、于在测定长波长下，溶液中只有被测组分对光有吸收，显色剂及其它组分对光没有吸收，或吸收很小,试剂空白：在相同条件下依次加入各种试剂和溶剂（不加试样溶液）所得到的空白溶液。,适用于在测定条件下，显色剂或其他试剂、溶剂对待测组分的测定有干扰情况,试样空白：在与显色反应同样条件下取同样量试样溶液，只是不加显色剂所制备的空白溶液。 适用于试样基体有色并在测定条件下有吸收，而显色剂溶液不干扰测定，也不与试样基体显色的情况,其它空白：不显色空白、平行操作空白等,6、分离,利用化学反应、萃取、色谱分离等方法除去干扰物质,控制吸光度测量范围,吸光度控制在0.2-0.7。,方法：调节溶液的浓度 改变吸收池的厚度,

17、4 紫外-可见分光光度计,在紫外-可见光区可任意选择不同波长的光测定吸光度的仪器,（一）光源 要求：发射强度高、稳定、具有连续光谱,钨灯和钨卤灯：波长覆盖宽，但紫外区很弱。常取波长大于350nm的光为可见区光源,氢灯和氘灯：发出波长为150-400nm的连续光谱。,一、主要部件,（二）单色器 从光源的连续光谱中分出单色光,组成：进口狭缝、准直镜、色散元件、出口狭缝,单色器光路示意图,1）色散元件：棱镜和光栅,棱镜:利用其对不同波长的光有不同的折射率。,缺点：色散后光谱按波长排列疏密不均，长波区密，短波区疏。为非均匀分布光谱。,光栅:利用光的干涉作用。,特点：色散后的光谱，各谱线间距离相等，为均

18、匀分布的连续光谱。,2）准直镜：以狭缝为焦点的聚光镜。将发散光变为平行光，将色散后的平行光聚焦。,3）狭缝：狭缝宽度直接影响分光质量。过宽，单色光不纯，太窄，光通量小，降低灵敏度。,（三）吸收池（比色池、比色皿）,玻璃比色皿，只能用于可见光区。,石英比色皿，可用于紫外光区和可见光区。,型号有：0.5、1.0、2.0、5.0cm,（四）检测器 将光能转变成电能的装置。,光电池：是一种光敏半导体。,要求：灵敏度高，噪声低,分类：硒光电池和硅光电池。,特点：光电流大小与照射光强成正比。 光电流不易放大，光强弱时，不能测量。 易“疲劳”，不能长时间使用。,A,光电管,光,阳极,光敏阴极,放大器,指示器

19、,特点：电流可放大，较有高灵敏度。 有“疲劳现象”,光电倍增管,光电倍增管大大提高了仪器测量的灵敏度。,光二极管阵列检测器：由一系列的二极管紧密排列在一块硅晶体片上组成。,光,例：HP8452A型二极管阵列：波长范围为190-820nm，二极管316个。,A,特点：测量速度快,（五）信号显示系统（记录系统）,分类：指针显示 数字显示,二、分光光度计的类型,1、单光束分光光度计,特点：仪器结构简单，灵敏度高，但对光源发光强度稳定性要求高。,2、双光束分光光度计,特点：可减免因光源强度不稳而引入的误差，但灵敏度较单光束差。,3、双波长分光光度计 将同一光源发出的光分为两束，分别经过两个单色器，从而

20、可以同时得到两个波长（1和2）的单色光，两个波长的单色光交替地照射同一溶液，检测其信号,能测定高浓度试样，多组分混合试样及浑浊试样,4、二极管阵列检测的分光光度计,特点：全波长测定，测定速度快。,5 分析方法,一、定性方法,光谱特征：光谱形状、吸收峰数目、吸收峰 波长、强度和吸收系数,定性依据：1、结构相同的化合物在相同条件 下有完全相同的吸收光谱,2、吸收光谱不同，一定不是相同物质。,3、吸收光谱相同，可能是相同物质。,定性鉴别方法：对比法,将样品与对照品的光谱进行对照、比较 将样品光谱与标准图谱进行比较,1、比较吸收光谱,三种甾体激素的紫外吸收光谱,（10mg/ml甲醇溶液）,2、比较吸收

21、光谱的特征数据,比较max、或,例2 安宫黄体酮（Mr=386.5）和炔诺酮（Mr=298.4）,max2401nm,=408,max2401nm,=571,3、比较吸光度（吸光系数）的比值,不只一个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处测得吸光度比值作为鉴别的依据。 可消除绝对误差(或浓度、吸收池厚度)。,例3 中国药典（2005年版）对维生素B12采用下述方法鉴别：将检品按规定方法配成25mg/ml的溶液，分别测定278nm、361nm和550nm处的吸光度A1、A2和A3，A2/A1应为1.701.88；A2/A3应为3.153.45。,推测分子骨架、判断发色团之间的共轭关系、估计共轭体系中

22、取代基的种类、位置及数目等,二、结构分析,1、从吸收光谱中初步推断官能团,紫外光谱提供的信息,化合物在220700nm内无吸收，其可能是脂肪烃、脂环烃或其衍生物，还可能是非共轭烯烃 220250nm范围有强吸收带说明分子结构中存在一个共轭体系（共轭二烯或、-不饱和醛、酮）,200250nm范围有强吸收带（lg34），250-290nm范围有中等强度吸收带（lg2-3）或有精细结构，说明结构中含有苯基 250350nm范围有弱吸收带（R带），说明分子结构中含有醛、酮羰基或共轭羰基。 300nm以上的强吸收带，说明化合物具有两个以上较大的共轭体系。若吸收强且具有明显的精细结构，说明为稠环芳烃、稠环

23、杂芳烃或其衍生物。,2、判断顺反异构体,空间位阻的影响,3、判断互变异构体,某些有机物在溶液中可能有两个或两个以上容易互变的异构体。,例如，乙酰乙酸乙酯是比较典型的具有酮式和烯醇 式互变异构的化合物：,酮式,烯醇式,在204nm处有弱吸收,在245nm处有强吸收,三、纯度检查,利用待测物与杂质在紫外-可见光区吸收的差异，选用适当波长可以进行待测物的纯度检查,肾上腺素（虚线）与肾上腺酮的吸收光谱,中国药典（05版）中规定2mg/ ml的样品溶液在310nm处的吸收度不得超过0.05，限量为0.06%（吸收系数为453）。,四、定量分析,（一）单组分分析,常用的单组分定量分析方法有标准曲线法、标准对照法、吸收系数法等,1、工作曲线法（标准曲线法）,步骤： 标准曲线的绘制 配制系列浓度标准溶液，测定吸光度，绘制曲线。,测定样品吸光度。,从标准曲线或回归方程中求样品浓度。,标准曲线法应注意的问题,（1）制备一条标准曲线至少要57个点 （2）待测液浓度应包括在标准曲线浓度范围内 （3）供试品溶液和对照品溶液必须在相同的操 作条件下测定。 （4）仪器更换元件，维修或重新校正波长时， 必须重新制作标准曲线。,不过原点的原因：,（1）空白溶液的选择不当，不能完全消除干扰,（2）显