色谱法原理1.ppt

1、Chapter 10 Chromatographic Analysis Lecture 1Lectured by S Wu,第十章 色谱分析法 Chromatographic Analysis,10.1 色谱分析原理 Principles of Chromatography 10.2 气相色谱法 Gas Chromatography 10.3 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 10.4 色谱法应用 Applications of Chromatography,Section 10.1,Principles of chromatogra

2、phy,10.1 色谱法原理 Principles of Chromatography,1 概述 Overview 1903年,俄国植物学家兹维特分离植物色素； 后来出现了种类繁多的各种色谱法。 基本特点：具备两个相：固定相和流动相 固定相：Stationary phase 固定不动的相 流动相：Mobil phase 携带样品流过固定相的流动体。 当流动相中样品混合物经过固定相时，与固定相发生作用。由于各组分性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,Michael Tswett(

3、1872-1919), a Russian botanist , discovered the basic principles of column chromatography. He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate. The various pigments separated into colored bands; hence the name chromatography.,分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末

4、的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法。,色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J. P. Martin(马丁)和R.L.M. Synge(辛格)，他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。 色谱法的特点：Features 分离效率高；分析速度快；检测灵敏度高；样品用量少；选择性好；多组分同时分析；易于自动化。 定性能力较差。,A.J. P.

5、 MARTIN 和R.L.M. Synge,A.J. P. MARTIN. (1910-2002) of the British National Institute for Medical Research shared with fellow countryman R. L. M Synge the Nobel Prize in Chemistry (1952) for the invention of partition chromatography. R.L.M. Synge born Oct. 28, 1914, Liverpool, Eng. died Aug. 18, 1994,

6、 Norwich, Norfolk. Synge studied at Winchester College, Cambridge, and received his Ph.D. at Trinity College there in 1941.,色谱法的发展历史 Developing history,色谱法的诺贝尔奖研究工作 Nobel prizes,色谱流出曲线（色谱图） 混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,微观分离过程Microcosmic separation process,色谱法分类 Classification,(1) 按两相状态 According to sta

7、tes of two phases A. 气相色谱(GC): 气体为流动相 根据固定相是固体吸附剂还是固定液又可分为气固色谱(GSC)和气液色谱(GLC) B. 液相色谱(LC): 液体为流动相 分为液固色谱(LSC)和液液色谱(LLC) C. 超临界流体色谱(SFC): 超临界流体为流动相 随着色谱的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。,(2) 按分离机理分类 According to separation mechanisms,吸附色谱法：Adsorption chromatography 组分在固定相上的吸附能力强弱不同而分离

8、的方法。 分配色谱法：Partition chromatography 组分在固定液（固定相）中溶解度不同而分离的方法。 离子交换色谱法：Ion exchange chromatography 组分在固定相上的亲和力不同而分离的方法。 凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法： Gel chromatography or Size exclusion chromatography 大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而分离的方法。 亲和色谱法：Affinity chromatography 不同组分与固定相的高专属性亲和力进行分离的技术，常用于蛋白质的分离 。,(3) 按固定相的外形分类 Accordin

9、g to shapes of stationary phases 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。,根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中。,2 色谱流出曲线及有关术语 Effusion curve and relate items,(1) 流出曲线和色谱峰 Effusion curve and chromatographic peak,如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：,式中：C不同时间t时某物质的浓度，C0进样浓度，tr保留时间，标准偏差。,(2) 基线

10、 Base line,是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图中Ot线稳定的基线应该是一条水平直线.,(3) 峰高 Peak height,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图中BA,(4) 保留值 Retention value,A死时间tM Dead time 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图中 OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速时，可用柱长L与tM的比值计算。,试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图 OB它相应于样品到达柱末端

11、的检测器所需的时间,B保留时间tR Retention time,C调整保留时间tR Adjusted retention time 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即 tR = tR- tM,由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR实际上是组份在固定相中停留的总时间保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如cm）表示。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定,D死体积 VM Dead volume 指色谱柱在填充后，柱管

12、内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（Lmin）计算： VM = tMF0,E保留体积 VR Retention volume 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间tR的关系如下： VR = tRF0,F调整保留体积VR Adjusted retention volume 某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即 VR = VR- VM,G相对保留值2.1 Relative retention value 组份2的调整保留值与组

13、份1的调整保留值之比，称为相对保留值：,由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法，特别是气相色谱法广泛使用的定性数据 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比 .,H.选择因子 Selectivity factor 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值此时， 可能大于1，也可能小于1在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数在这种特殊情况下，可用符号表示：,式中tR2为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的 。,色谱峰的区域

14、宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：,1. 标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图中EF距离的一半。 2. 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，如图中GH间的距离它与标准偏差的关系是： W1/2 = 2.354,五、区域宽度 Peak width,即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中IJ的距离它与标准偏差。的关系是： W = 4,3.基线宽度W,从色谱流出曲线上，得到信息是：,（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数 （2）根据色谱峰的保留值(或位置)，可以进行定性分析 (3) 根据色谱

15、峰下的面积或峰高，可以进行定量分析 （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相和流动相选择是否合适的依据,3. 色谱分析的基本原理 Fundamental of chromatographic anaysis 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和

16、动力学两方面来研究色谱行为。,一、分配系数K和分配比k Partition coefficient and Partition ratio,(1)分配系数K Partition coefficient 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即,(2). 分配比k Partition ratio,分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡

17、时，分配在固定相和流动相中的物质的量比。即,k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。,式中Cs，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度； Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。,(3). 滞留因子Rs Retention factor,分配比k值可直接从色谱图测得。

18、设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs。,Rs若用物质的量分数表示，即,对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为,整理公式，可得,(4). 分配系数K与分配比k的关系 Relation between Partition coefficient and Partition ratio,其中称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。,(5)分配系数K及分配比k与选择因子的关系 Relations between K, k and ,根

19、据对以上公式处理，对A、B两组分的选择因子，可用下式表示,上式表明：通过选择因子把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。,二 塔板理论（plate theory）,该理论假定： （i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段

20、柱长称为理论塔板高度H。 （ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。 （iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。 （iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。 为简单起见，设色谱往由5块塔板（n5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2，nl；某组分的分配比k=1.,根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下： 开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（l

21、V）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5气液（或气固）相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。,按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）,由塔板理论可建流出曲线方程：,m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。 当流动相体积V=Vr 时，C值最大，即,色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,从上两式可以看出，色谱峰宽W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。 通常填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细