《医学分子生物学》课件：第二十四章 疾病相关基因的鉴定与基因功能研究

1、第二十四章 疾病相关基因的鉴定与基因功能研究,疾病相关基因,致病基因：基因结构或表达的异常是疾病发生的直接原因 （主要是单基因病）,疾病易感基因：环境因素和遗传因素共同作用，涉及多个基因的相互作用（多基因病）,肿瘤 心血管疾病 自身免疫性疾病 代谢性疾病,第一节 鉴定疾病相关基因的原则,一、鉴定疾病相关基因的关键是确定疾病表型和基因间的实质联系,正确的诊断是鉴定疾病基因的先决条件 确定疾病的遗传因素，即通过家系分析确定遗传因素在疾病发生中的作用。,二、鉴定克隆疾病相关基因需要多学科多途径的综合策略,三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方法的交汇,一旦候选基因被鉴定，即可筛检患者中该基因的突变

2、。,第二节 疾病相关基因克隆的策略和方法,一、不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略,包括： 功能克隆、表型克隆、采用位点非依赖的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾病基因。,（一）功能克隆,采用从蛋白质到DNA的研究路线，针对一些引起疾病发生的功能蛋白。如苯丙酮尿症相关的酪氨酸羟化酶基因，与镰刀型细胞贫血症相关的珠蛋白基因。,1依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆疾病 相关基因 （Pr表达丰富） 2用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因 （ Pr表 达微量）,（functional cloning）,单基因疾病基因克隆常用的策略,（质谱或化学法分析氨基酸序列，设计探针，钓取cDNA文库）,抗体与新

3、生肽链（同时附着核糖体上的mRNA，分析mRNA；抗体与cDNA阳性克隆结合）,（二）表型克隆,前提：对疾病表型和基因结构/表达的特征联系已有所认识,多基因疾病基因克隆常用的策略,（phenotype cloning）,根据疾病表型，比较患者与正常人的基因组DNA，直接克隆变异DNA片段。（重复序列的拷贝数，动态突变） 针对已知基因。若高度怀疑某疾病是由某已知基因所致，可比较该基因在患者和正常人间的表达差异，以确定该基因是否为该疾病相关基因。 3. 针对未知基因，比较mRNA的种类和含量在患者和正常组织的差异，并克隆疾病相关基因。,依据基因改变与疾病表型的关系，有几种策略：,针对未知基因常用的

4、技术有,mRNA差异显示（mRNA differential display，mRNA-DD） 抑制消减杂交（suppressive substractive hybridization，SSH） 基因表达系列分析（SAGE） cDNA微阵列 （cDNA microarray） 基因鉴定集成法 （integrated procedure for gene identification）,RDA技术原理和基本过程示意图,代表性差异分析 (representational difference analysis),正常,患者,若无驱动DNA结合，则检测DNA自身复性，因两端都有接头，故可扩增,mR

5、NA差异显示(mRNA differential display，mRNA-DD),mRNA-DD技术原理和基本过程示意图,差异显示逆转录PCR,5随机引物 3锚定引物 （可扩增所有哺乳类生物mRNA),（三）采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因,若已知动物的某疾病表型的突变基因的染色体定位, 则具有相似表型的人类疾病的致病基因有可能存在于人类染色体的同源部位。 当动物模型的疾病基因已被鉴定，还可用荧光原位杂交定位分离人的同源基因。,二、定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法,1. 确定疾病相关基因在染色体的位置; 2. 用DNA标记确定特定基因组区域; 3. 以基因组区域的相连重叠群 筛选候选基因

6、; 4. 比较患者和正常人基因的差异，确定基因和疾病的关系。,定位克隆（positional cloning）：,根据疾病基因在染色体上的大体位置，鉴定克隆疾病相关基因。,（一）基因定位的方法,1体细胞杂交法通过融合细胞的筛查定位基因 2染色体原位杂交是在细胞水平定位基因的常用方法 染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法 4. 连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法,急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位,（二）定位克隆的基本程序包括三大步骤,1尽可能缩小染色体上的候选区域 2构建目的区域的物理图谱 3. 疾病相关基因的确定,得到区域性窄的DNA重叠群克隆后，进一步对变异位点进行确定： 1

7、）cDNA直接筛选：病变组织cDNA与DNA克隆杂交，筛选此区域 的特异表达基因。 2）候选基因克隆法：对该区域中的已知基因测序，比较变异情况， 确定变异位点。 3）对克隆直接测序,（三）例：假肥大型肌营养不良（DMD） 基因的克隆,最后证明DMD基因约2300 kb,女患者：X染色体与第21号常染色体易位,根据,男患儿：Xp21.2缺失，伴发其他X连锁隐性遗传病,RFLP连锁分析,DMD基因定位于Xp21,分别克隆得到基因的2个片段,后称为XJ系列探针和pERT87系列探针,三、确定常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序,全外显子测序,全基因组的关联研究,在全基因组层面，对大规模群体

8、DNA进行全基因组高密度遗传标记（如SNP）分型，寻找与疾病相关的遗传因素。,全基因组外显子进行高通量测序,四、生物信息数据库贮藏丰富的疾病相关基因信息,将已获序列与数据库中核酸及蛋白质序列进行同源性比较，或对数据库中不同物种序列比较分析、拼接，预测新的全长基因，通过实验证实，从组织细胞中克隆该基因，即所谓的电子克隆 。,第三节 疾病相关基因的功能研究,基因的功能实际是基因产物的功能，也就是编码基因的蛋白质功能（本节讨论的重点）和非编码基因RNA的功能。,蛋白质功能描述的三个不同水平： 生物化学水平 细胞水平：细胞内定位和参与的生物学途径 整体水平：基因表达的时空性及在疾病中的作用,（如DNA

9、的修复过程）,一、基因比对及功能诠释,BLAST：美国国立生物技术信息中心（NCBI，/）开发。 FASTA：欧洲生物信息学研究所（EBI，http:/www.ebi.ac.uk/）开发。,新基因功能研究的第一步：在数据库中进行序列比对。,常用的两大双序列比对工具：,根据分子进化理论：核酸或氨基酸序列相似的基因，功能相似。,二、利用工程细胞研究基因功能,（一）采用基因重组技术建立基因高表达工程细胞系 （二）基因沉默技术抑制特异基因的表达,三、研究生物大分子间的相互作用可确定基因功能,在某些情况下, 即使对基因的序列、结构和表达模式有清楚的认识，但仍然难以阐明基因所表达的蛋白质的功能。此时需研究该蛋