ELISA检测抗体.ppt

1、第四次试验ELISA法血清抗体检测免疫胶体金法检测早早孕,免疫学教研室,重点实验(写实验报告）, （2） 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; （3） 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果.,常用ELISA方法,1 直接法：检测抗原 A:将待检测抗原吸附在固相载体表面； B:加酶标抗体，形成抗原-抗体-酶复合物； C:加底物。底物的降解量抗原量。 2 间接法 ：检测抗体（本次ELISA方法） A: 将已

2、知抗原吸附于固相载体表面； B: 加待检测抗体，形成抗原抗体复合物； C: 加酶标二抗； D: 加底物。测定底物降解量=抗体量,常用ELISA方法,3 双抗体夹心法：检测抗原 A:将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面； B:加待检抗原，形成抗原-抗体复合物； C:加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物； D:加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体)； E:加底物。底物的降解量抗原量。,；,常用ELISA方法,4 竞争法：测定抗原 A:将抗体吸附在固相载体表面； B:对照孔只加入酶标抗原； C:样品孔加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； D:加底物。对照孔与样品孔底物降解量

3、的差未知抗原量。,各种ELISA原理,竞争法: 标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。,间接法: 利用酶标抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体,应用,定性、定量检测抗原和抗体水平 间接法ELISA：检测Ab 双抗体夹心法ELISA：检测Ag 竞争法ELISA：检测Ag,注意事项,封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。 加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。 加不同样品时更换枪头 每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1 分钟。可水平震荡，增强洗涤效果。 洗涤后板要甩干，不要残留液体。 加终止液后10分钟内测量OD值。,结果分析,阳性对照与阴性对照：阳性对照显色应

4、明显深于阴性对照，否则该实验失败。阴性对照应接近无色，否则反应本底过高，影响反应灵敏度。待测样品：以阴性对照为参考，根据待测孔颜色深浅，将待测样品中特异性抗体浓度标为“-”（无色），“+”（浅色），“+ +”（黄色），“+ + +”（棕黄色）。 本次ELISA采用的是间接法检测抗体，定性检测。,免疫胶体金技术,免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态

5、，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。,常用免疫胶体金技术,（1）免疫胶体金光镜染色法 （2）免疫胶体金电镜染色法 （3）胶体金免疫层析法,胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与

6、之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。如检测早早孕,实验报告,实验原理 实验目的 实验相关试剂和器材 实验流程 实验结果 讨论分析,试剂与器材,待测血清、阳性对照、阴性对照血清。 样品稀释液（PBS） 包被液：绵羊红细胞抗原+PH9.6碳酸盐缓冲液 封闭液:5% BSA/PBS 溶液 洗涤液:PBST，(含Tween-20的PBS液) 辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠抗体，即酶标二抗 一端与辣根过氧化物酶结合，另一端与血清中抗SRBC抗体的C区结合 底物缓冲液A液（0.1mol/L枸橼酸溶液）B液（0.2mol/L Na

7、2HPO4）： 底物是现用现配，A 和B液混合后，15min内使用。 邻苯二胺 H2O2 终止液：2mol/L 硫酸。 聚乙烯ELISA板，微量加样器，枪头，滤纸，37度温箱，EP管。,实验流程,SRBC冻融稀释包被液每孔100ul37度1h弃液，洗板三次加封闭液每孔200ul37C温箱孵育30 min弃液，洗板3次阳性对照，阴性对照,待测一（本组），待测二（邻组）每孔100ul37C温箱孵育1h(不少于1h)弃液，洗板3次加入酶标二抗每孔100ul37C温箱孵育 1h(不少于1h) 弃液，洗板不少于7次加入底物各100ul室温避光反应10 min每孔加入终止液50ul目测观察或酶标仪检测。,实验课总结,我们在四次免疫学实验课中系统的学习了体液免疫和细胞免疫的经典和常用的一些免疫学实验技术。第一次实验课的抗原免疫小鼠，小鼠产生体液免疫应答，一周后血清中出现抗绵羊红细胞抗体。同时也出现细胞免疫应答，免疫细胞也得到活化。第二次实验课取血，得到免疫血清。并进行了脾细胞的计数。第三次实验课又用流式细胞术分析了小鼠体内T细胞免疫功能的变化，并通过检测NO水平来观察巨噬细胞功能的活化。用双扩实验、凝集实验和补体结合实验验证了一些理论并观察了实验现象。第四次课用ELISA法检测了小鼠血清抗体的水平。并用免疫胶体金法做早