禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物_W

1、*CN101920022A*CN101920022A*(19) 人民 国家知识产权局(12)发明专利申请(21)申请号 201010159652.1 (22)申请日 2010.04.29 (71) 申请人 韩健宝 地址 210014 江苏省南京市江宁区 21 世纪 假日花园 27 栋 203 室 (72) 发明人 韩健宝 (10)申请公布号 CN 101920022 A CN 101920022 A(43)申请公布日 2010.12.22 (51)Int.Cl.A61K 48/00 (2006.01) A61P 31/16 (2006.01) 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 4 页

2、附图 0 页 (54) 发明名称禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物 (57) 摘要A 2 20 02 91 0 1 N C CN 101920022 A本发明公开了一种禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。本发明的禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为四种单体反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列 4、序列 7、序列 11 和序列 14。本发明的禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物具备高水平的生物利用度、稳定理化性能，无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死 AIV，抗病毒效果好，成本低廉。 CN 101920023 ACN 101920022 A权利要

3、求书1/1 页 1. 禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为四种反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列 4、序列 7、序列 11 和序列 14。 2. 根据权利要求 1 所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于 ：所述四种反义核酸为任意质量比。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于 ：所述四种反义核酸的质量比为 1 1 1 1。 4. 根据权利要求 3 所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于 ：还包括可药用载体或赋形剂。 2 CN 101920023 A 说明书CN 101920022 A1/8 页禽流行 冒病毒的特异性抗病毒反义核酸

4、药物技术领域0001 本发明涉及禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。 背景技术0002 是由正黏病毒科甲型流感病毒引起的一种禽烈性传染病，其临床表现为呼吸系统疾病、产蛋下降等。曾在世界各地爆发流行，引起禽只大量死亡及生产性能的急剧下降，使养禽业遭受巨大的经济损失。陆基家禽，水禽及野鸟均可被感染，以引起呼吸系统和严重败血症以致全身多脏器功能衰竭，病情进展快、病死率高为主要特征。 的 15 个国家暴发了人疫情，共造成 412 人感染，其中 256 人死亡。在禽类中传染的 所有病毒中，H5N1 病毒现已具备大流行开始所需的所有先决条件，即迄今为止， H5N1 病毒造成严重病情人数和最多，它跨越了

5、物种传染屏障，从禽类传染到了人类。一旦形成有效的人与人之间的传播，H5N1 病毒将变异成引起新一轮流感疫情所需的特性。0004 目前，急需一种具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的禽流行冒 病毒的特异性抗病毒药物。 发明内容0005本发明的目的是提供一种具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。 0006本发明所提供的禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为四种反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列 4、序列 7、序列 11 和序列 14。 0007 本发明的禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中 ：

6、所述四种反义核酸为任意质量比。 0008 本发明的禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中 ：所述四种反义核酸的质量比为 1 1 1 1。 0009 本发明的禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中 ：还包括可药用载体或赋形剂。 0010 本发明的禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物具备高水平的生物利用度、稳定理化性能，无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死 AIV，抗病毒效果好，成本低廉。 具体实施方式0011 人工合成如下反义核酸 ： 3 CN 101920023 A 说明书CN 101920022 A2/8 页 0012AM1 ：5-CAUCCACAUCACUCUGCUGUU-

7、3； 0013AM2 ：5-CCUGCCGUAGAUGGCCCUCUU-3； 0014AM3 ：5-AAGGCGAGGAUAAAUGCAUUU-3； 0015AM4 ：5-GCAACAACAAGAGGAUCACUU-3； 0016ANP1 ：5-AUUGUCAUACUCCUCAGCAUU-3； 0017ANP2 ：5-CUGUGACUUGGUCAUCAUCUU-3； 0018ANP3 ：5-AAUUCCCCUUUGACGCGUAUU-3； 0019ANP4 ：5-UUGAACAAGCCCAUCAUCAUU-3； 0020APA1 ：5-CACCGAGAGCCCAGUUUAAUU-3； 0021

8、APA2 ：5-CGUUUUCCGCCUUCCUUCUUU-3； 0022APA3 ：5-GAAUGUGGUACUUGUAGCAUU-3； 0023APA4 ：5-UCUUUGUGAUACCAUUUUCUU-3； 0024APB1 ：5-GUCCAUCAACCGGGUUGAGUU-3； 0025APB2 ：5-UACCAUUCUCUUGGUCCUGUU-3； 0026APB3 ：5-GAAUGUGGUGCUUAUAGCAUU-3； 0027APB4 ：5-UUUCCCUAAGCUAGCCAUCUU-3。 0028流感毒株 ：H5N1，H9N2 0029实验条件 ：涉及 H5 亚型的在 BSL-

9、3 实验室进行，其它在 BSL-2 实验室进行。 0030细胞系 ：犬肾细胞 MDCK 0031反义核酸 ：均为 1.5g/ml 0032采用细胞病变级数指标测定反义核酸抗病毒活性 . 0033Day1 ： 0034铺板 ：消化前期准备的 MDCK 细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基将细胞浓度 调到 1105 个 /ml，铺 24 孔板，于 37二氧化碳培养箱中进行培养 18-24 小时。 0035Day2 ： 0036显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的 70 80时，且细胞状态良好。吸去培养液，每孔加入 300l 待筛选药物，每个药物 10 个孔。温育 1 小时后，加入 100l

10、 流感病毒( 感染比为0.01)，吸附2 小时后，用营养液洗去未吸附的病毒后，再加入完全培养基，在 37和 5 CO2 环境中继续培养。实验过程中还设不加病毒和反义核酸的正常细胞对照组，加病毒、不加反义核酸阳性对照组和加反义核酸药物、不加病毒的对照组。0037Day3-5 ： 0038观察药物对细胞的保护效应，并对结果进行评判。 0039结果评判 ：对照组成立和细胞病变评判指标。 0040(1) 正常细胞对照组实验过程无病变 ；阳性对照组出现细胞病变，且到实验结束时 90以上细胞产生病变 ；药物对照实验过程细胞无病变。 0041(2) 细胞病变评判指标 ： 0042细胞无病变-细胞病变在 25

11、以下+ 0043细胞病变在 26 -50+细胞病变在 51 -75+0044细胞病变在 76 -100+ 4 CN 101920023 A 说明书CN 101920022 A3/8 页0045实验组筛选结果如表 1. 0046表 1. 反义核酸在细胞上的抗病毒活性分析 00475 CN 101920023 A 说明书CN 101920022 A4/8 页00480049上述细胞病毒实验分析结果表明 AM4、ANP3、APA3、APB2 为优选。 0050毒性分析 0051Day1 ： 0052铺板 ：消化前期准备的 MDCK 细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基将细胞浓度 调到 1105 个

12、 /ml，铺 24 孔板，在 37二氧化碳培养箱中培养 18-24 小时。 0053Day2 ： 0054 显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的 70 80时，且细胞状态良好。吸去培养液，每孔加入 300l 待筛选药物，每种药物加 10 孔。在 37和 5 CO2 环境中继续培养继续培养。实验过程中设只加 PBS 液无反义核酸的对照组。 0055 Day3-5 ： 0056 观察药物对细胞的毒性效应，并对结果进行评判，结果如表 2。 7 CN 101920023 A 说明书CN 101920022 A5/8 页0057表 2. 反义核酸毒性分析 005800597 CN 10192002

13、3 A 说明书CN 101920022 A6/8 页0060 四种反义核酸 AM4、ANP3、APA3 和 APB2 按照任意质量比混合制成本发明的反义核酸药物。 0061 具体以反义核酸 AM4、ANP3、APA3 和 APB2 按照质量比为 1 1 1 1 混合制成的反义核酸药物为例。 0062反义核酸药物稳定性分析 0063高温 ：流通蒸汽高温 105，20 分钟灭菌不影响其生物活性。 0064温度 ：50存放 2 个月不影响其生物活性。 0065室温 ：存放 24 个月不影响其生物活性。 0066低温 ：-20存放 48 个月不影响其生物活性。 0067动物实验 0068试验动物 ：2

14、0 日龄的 SPF 鸡 160 只，分成 16 组，每组 10 只。 0069病毒 ：H5N1，H9N2 0070实施方案 0071( 一) 药效性试验 ：将实验组用H5N1 或H9N2 毒感染( 感染毒剂量 ：100 个TCID50)， 24 小时后，分别肌肉注射各单体反义核酸或本发明的核酸药物，剂量均为 10g，并设只攻毒不用反义核酸阳性对照组和设立只用反义核酸、不攻毒的作为对照组。攻毒后每日观察鸡的情况，14 天后统计鸡死亡数 ( 见表 3、表 4)。 0072 表 3、各单体反义核酸及本发明核酸药物对 SPF 鸡人工感染H5N1 毒后的治疗性试验结果 007300748 CN 1019

15、20023 A 说明书CN 101920022 A7/8 页0075表 4、各单体反义核酸及本发明核酸药物对 SPF 鸡感染H9N2 后的治疗性试验结果 00760077( 二 ) 不同给药组对鸡体内病毒抑制试验 ：鸡只在注射反义核酸药物 72 小时和168 小时后，分别用灭菌的棉拭子涂擦泄殖腔，将浸透分泌物的棉拭子放入含青霉素、链霉素 2000U/ml 的 HANKS 液中，充分捻动、震荡，8000 转 /min，离心 10min，取上清液作为接种材料。分别接种10 日龄SPF 鸡胚，培养5d 后冻死活胚，全部测定血凝性，以HA 效价 2log2 判定为鸡只排病毒阳性 ( 见表 5)，结果表

16、明本发明的反义核酸可以获得良好的治疗效果。 0078表 5. 各单体反义核酸及本发明核酸药物对 SPF 鸡感染 H5N1，H9N2 抑制效果00799 CN 101920023 A 说明书CN 101920022 A8/8 页10 CN 101920023 A 序列表CN 101920022 A1/4 页11 韩健宝 序列表 禽流行冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物 16 1 21 RNA 人工序列 1 cauccacauc acucugcugu u21 2 21 RNA 人工序列 2 ccugccguag auggcccucu u21 3 21 RNA 人工序列 3 aaggcgagga ua

17、aaugcauu u21 4 21 RNA 人工序列 4 gcaacaacaa gaggaucacu u21 CN 101920023 A 序列表CN 101920022 A2/4 页5 21 RNA 人工序列 5 auugucauac uccucagcau u216 21 RNA 人工序列 u 21 u 216 cugugacuug gucaucaucu7 21 RNA 人工序列 7 aauuccccuu ugacgcguau8 21 RNA 人工序列 8 uugaacaagc ccaucaucau u219 21 RNA 人工序列 9 caccgagagc ccaguuuaau u2112 CN 101920023 A 序列表CN 101920022 A3/4 页10 21 RNA u 21 u 21 人工序列 10 cguuuuccgc cuuccuucuu11 21 RNA 人工序列 11 gaaugug