A重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则-Biotechn.ppt

1、A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则,外源基因表达产物的分离纯化,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,多种分离纯化技术的联合运用,合适分离纯化介质的选择,分离纯化过程的规模化,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在,纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；,采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；,采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选,用亲和层析进行纯化,表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶,菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。,针

2、对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子,交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；,重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析,纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合,适的范围内（10-8- 10-4 mol / L）；,疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；,凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；,径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种,复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。,多种分离纯化技术的联合运用,在进行重组蛋白的纯化时

3、，通常需要综合使用多种技术，一般来,说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：,应选择不同分离纯化机理的方法联合使用,应首先选择能除去含量最多杂质的方法,应尽量选择高效的分离方法,应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段,合适分离纯化介质的选择,常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分,离纯化介质应具有下列性质：,对目标蛋白具有较高的分离效率,对目标蛋白不会造成变性,化学性能和机械性能稳定，重复性好,价格低廉,分离纯化过程的规模化,蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程,未必合适，如：,实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）,实验

4、室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）,因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。,B 离子交换层析,10 外源基因表达产物的分离纯化,离子交换层析的基本原理,离子交换介质的基本性质,离子交换层析的基本操作,离子交换介质的选择原则,离子交换层析的基本原理,离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为,流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混,合物中不同离子进行分离的层析技术。,离子交换介质的基本性质,离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物,如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；,离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它

5、阳,离子交换剂的基本性能,离子或阴离子起交换作用,如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗,脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数,吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去,电荷而解离下来,不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大,小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个,洗脱下来，达到分离纯化的目的,离子交换介质的基本性质,阴离子交换剂：强碱型和弱碱型,可电离的基团磺酸基（-SO3H）,离子交换剂的分类,磷酸基（-PO3H2）,羧酸基（-COOH）,酚羟基（-OH）,阳离子交换剂：强酸型和弱酸型,可电离的基团伯

6、胺基（-NH2）,仲胺基（-NHCH3 ）,叔胺基（-N(CH3)2）,季胺基（-N+(CH3) 3 ）,离子交换介质的基本性质,离子交换剂的分类,强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽,弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小,弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子,交换能力逐渐减弱,弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子,交换能力逐渐减弱,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换树脂：,最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯,乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物,离子交换树脂的优点是：

7、流速快，对小分子物质的交换容量大，,因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换纤维素：,离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水,性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大,分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大,阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等,维素）,阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换葡聚糖：,离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三,维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物

8、（Sephadex G）,Sephadex的优点如下：,亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核,酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小,电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快,既有离子交换作用，又有分子筛效应,因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换葡聚糖：,常用的离子交换葡聚糖包括：,阳离子交换剂CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50,Sephadex C-25，Sephadex C-50,阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-

9、50,QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换琼脂糖：,离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B,DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）,尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因,的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点,此具有稳定的外形体积,离子交换介质的选择原则,一般而言：,酸性物质用阴离子交换剂分离,氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化,碱性物质用阳离子交换剂分离,曲线来选择

10、,离子交换介质的选择原则,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋 白 质 净 电 荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH pI（-）,对pI=5的某酸性蛋白质,在pH5.5-9.0的范围内，,当蛋白质为阴离子时，,应首选DEAE纤维素；,在pH3.5-4.5的范围内，,当蛋白质为阳离子时，,应首选CM纤维素,离子交换层析的基本操作,层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍,平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致,为准，其中pH值最重要,离子交换层析的基本操作,样品进柱,为了达到满意的分离效果，进样

11、量一般为介质交换容量的10-20%,为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高,交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数,离子交换层析的基本操作,样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH值,C 凝胶层析,10 外源基因表达产物的分离纯化,凝胶层析的基本原理,凝胶介质的基本性质,凝胶层析的基本操作,凝胶介质的选用原则,凝胶层析的基本原理,凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合,物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛,分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶

12、颗粒之,外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们,下行速度快,分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙,即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢,鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定,以及分离纯化。,凝胶介质的基本性质,葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G,150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升,葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解,湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温,葡聚糖凝胶（ Sephadex ）,Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex

13、，这类层析介质的流动相既,可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶,质的凝胶过滤,凝胶介质的基本性质,琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose,（ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比 ）和Bio-Gel-A等,（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排,阻限度。,琼脂糖凝胶,当温度高于50时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。,琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大,分子物质（如蛋白质和DNA）。,Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔

14、径大小和分离范围,与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。,凝胶介质的基本性质,聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联,而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交,联剂越多，孔隙越小。,聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种,聚丙烯酰胺凝胶,（ 数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）,凝胶介质的选用原则,将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分,离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。,组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量,的物质（分子量范围

15、1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G-,组别分离,15、Bio-Gel P-2或P-4,凝胶介质的选用原则,将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离,该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。,分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由,分级分离,于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。,凝胶层析的基本操作,平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速,注意凝胶的断层和气泡,层析柱平衡,操作压控制,平衡和洗脱时应维持流速恒定,恒定的操作压是恒流的先决条件,凝胶层析的基

16、本操作,上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：,进样体积,进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%,进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能,窄，这样洗脱出的峰形好,D 亲和层析,10 外源基因表达产物的分离纯化,亲和层析的基本概念,亲和层析载体的性质与选择,亲和层析配基的性质与选择,亲和层析的基本操作,亲和层析的基本概念,亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力,进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：,纯化过程简单、迅速，且分离效率高,特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子,亲和层析的基本特点,纯化倍数大，产物纯度高,必须针对某一分离对象制备

17、专一的配基及寻求稳定的层析条件,因此应用范围受到一定的限制,亲和层析的基本概念,抗原与抗体,DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA),酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子,激素或药物与其受体,具有特异性亲和作用的生物分子,维生素于其特异性结合蛋白,糖蛋白与其相应的植物凝集素,亲和层析的基本概念,亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连,作为固定相吸附剂,当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有,和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结,亲和层析的基本原理,合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出,然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来,亲和层析载体的性

18、质与选择,具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过,具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速,亲和层析载体的选择,具有惰性，尽量减少非专一性吸附,具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合,偶联,在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性,亲和层析载体的性质与选择,纤维素,葡聚糖凝胶,常用的亲和层析载体,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,其它新型载体,亲和层析配基的性质与选择,纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力,但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的,亲和层析配基的选择,条件就要强烈，这样可能使生物分子变性,配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与

19、配基与生物,分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配,基与生物分子之间的亲和力,亲和层析配基的性质与选择,酸酐法,N-取代羟基琥珀酰亚胺法,配基的偶联,叠氮化作用,还原性烷基化合物（西夫碱）的形成,亲和层析的基本操作,通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等使与固定配,泛的是改变溶液的离子强度。,非专一性洗脱,化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低,基结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广,非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发,生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定,亲和层析的基本操作,使用特异的配基作为洗脱剂,溶液为洗

20、脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗,专一性洗脱,使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物,脱目标产物,亲和层析的基本操作,亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载,性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法,特殊性洗脱,体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。实际上特殊,E 膜分离,10 外源基因表达产物的分离纯化,膜分离的基本原理,分离膜的主要性能,影响膜分离的因素,膜分离的基本原理,膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为,化，它是一种物质被透过或被截留的过程，近似于筛分过程，依据滤,膜分离的基本定义,推动力，由于溶液中各组分透过膜的

21、迁移速率不同而实现的分离。,膜分离是利用具有一定选择性透过特性的介质进行物质的分离纯,膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的,膜分离的基本原理,分子级别的分离过程，分离效率高,膜分离的特点,不涉及相变，能耗低，运行成本低,膜分离为单纯物理变化，无二次污染,膜分离的基本原理,分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制,膜分离过程的重要参数,膜分离过程的推动力：静压力差、浓度差、电位差,物质通过分离膜的速度：是物质分离的第二机制,膜分离的基本原理,根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可,膜分离的主要类型,反渗透（Reverse osmosis RO）,透析（Dialysis DS

22、）,分成下列几类：,超滤（Uitrfiltration UF）,微滤（Microfitration MF）,电渗析（Electrodialysis EI）,膜分离的基本原理,透析（Dialysis DS）,膜分离的主要类型,透析过程使用一种只透过溶剂而不透过溶质的膜，一般称为理,当把溶剂和溶液（或把两种不同浓度的溶液）分别置于此两侧,想的半透膜,时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向溶液（或从低浓度向高浓,度）一侧流动，这种现象叫渗透,膜分离的基本原理,反渗透（Reverse osmosis RO）,膜分离的主要类型,反渗透其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质,溶解盐类、胶体、微生物

23、、热源、有机物等，因而主要用于海水、,不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中的,苦咸水淡化和产纯水制备等方面,膜分离的基本原理,超滤（Uitrfiltration UF）,膜分离的主要类型,超滤是一种根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相,相应的截留分子量范围从500到100万左右。,对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围1 nm - 0.1 mm，,分离膜的基本性能,分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离透过,性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电,性能和化学物理性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热,性能、毒性、机械强度等。,膜的化学物理性能,分离膜的基本性能,微滤膜0.025 - 14 mm,反渗透膜0.0001 - 0.001 mm,超滤膜0.001 - 0.02 mm,纳米过滤膜平均孔径 2 nm,膜的分类,按膜的孔径大小分类：,分离膜的基本性能,对称性膜膜截面上的孔道结构均匀,不对称性膜由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成,膜的分类,按膜的结构分类：,