川贝母检验标准操作规程

1、.川贝母检验标准操作规程文件编码： s0p-qc-zj-3017-03制定部门：质量检验中心题目颁发部门：质量管理部川贝母检验标准操作规程分发部门：质量管理部、质量制定人：日期 :年月日检验中心审核人：日期 :年月日批准人：日期：年月日生效日期 :2012年 10 月 1日变更历史： 1.2003 年 3月制定； 2.2005 年7月执行中国药典 2005年版第一次修订； 3.2010 年 10月执行中国药典 2010年版第二次修订。 4.2012 年10月 1 日执行中国药典 2010年版第一增补本第三次修订。目的：建立川贝母检验标准操作规程。规范检验操作，确保川贝母质量。适用范围：适用于川

2、贝母的检验。责 任 者：质量管理部经理、质检中心主任、质量检验员。内容：1 品名：川贝母2 取样：按药材和饮片取样标准操作规程（ sop-qc-zj-6065）取样3 检验依据：川贝母内控质量标准（ stp-qs-zj-3015）4 性状松贝 取本品，置明亮处用肉眼观察，呈类圆锥形或近球型 ,尺量，高 0.30.8cm，直径 0.30.9cm。，表面类白色。外层鳞叶 2 瓣，大小悬殊，大瓣紧抱小瓣，未抱部分呈新月形，习称“怀中抱月”；顶部闭合，内有类圆形，顶端稍尖的心芽和小鳞叶 12 枚；先端钝圆或稍尖，微凹入，中心有 1 灰褐色的鳞茎盘，偶有残存须根。质硬而脆，断面白色，富粉性。气微，味微苦

3、。青贝 呈类扁球形，高 0.41.4cm，直径 0.41.6cm。外层鳞叶 2 瓣，大小相近，相对抱合，顶部开裂，内有心芽和小鳞叶 23 枚及细圆柱形的残茎。炉贝 呈长圆形，高 0.72.5cm，直径 0.52.5cm。表面类白色或浅棕黄色，有的具棕色斑点。外层鳞叶 2 瓣，大小相近，顶部开裂而略尖，基部稍尖或较钝。;.5 鉴别：5.1仪器：显微镜、超声波清洗机、电子恒温水浴锅、薄层喷雾气压泵、电子天平5.2试剂与试液5.2.1试剂：二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、浓氨试液5.2.2 试液水合氯醛试液：取水合氯醛50g，加水 15ml 与甘油 10ml 使溶解，即得。甘油乙醇试液：取甘油、稀乙醇各1

4、 份，混合，即得。碘化钾溶液：取碘化钾16.5g ，加水使溶解成100ml，即得。临用新制。稀碘化铋钾试液：取次硝酸铋0.85g ，加冰醋酸 10ml 与水 40ml 溶解后，即得。临用前取5ml ，加碘化钾溶液（4 10） 5ml ，再加冰醋酸20ml，加水稀释至100ml，即得。亚硝酸钠乙醇试液：取亚硝酸钠1g，加乙醇使溶解成100ml，即得。5.3 对照品与：贝母辛对照品、贝母素乙对照品5.4 操作方法5.4.1按显微鉴别法标准操作规程（sop-qc-zj-6034）检查。松贝、青贝、取本品粉末 10g，过四号筛，平铺于洁净的白纸上，在明亮处用肉眼观察，本品粉末类白色。挑取少许置载玻片上

5、，滴加水合氯醛试液2 滴，将载玻片置酒精灯火焰上方 2cm处往返摆动加热至边缘起小泡，即停止加热，补充试液后再加热，直至透化完全。透化后放冷，加甘油乙醇2 滴，盖上盖玻片。置显微镜下观察，淀粉粒甚多，广卵形、长圆形或不规则圆形，有的边缘不平整或略作分枝状，直径564m，脐点短缝状、点状、人字状或马蹄状，层纹隐约可见。表皮细胞类长方形，垂周壁微波状弯曲，偶见不定式气孔，圆形或扁圆形。螺纹导管直径526m。炉贝取本品粉末 10g，过四号筛，平铺于洁净的白纸上，在明亮处用肉眼观察，本品粉末类白色。挑取少许置载玻片上，滴加水合氯醛试液2 滴，将载玻片置酒精灯火焰上方 2cm处往返摆动加热至边缘起小泡，

6、即停止加热，补充试液后再加热，直至;.透化完全。透化后放冷，加甘油乙醇2 滴，盖上盖玻片。置显微镜下观察，淀粉粒广卵形、贝壳形、肾形或椭圆形，直径约至60m，脐点人字状，星状或点状，层纹明显。5.4.2取本品粉末 10g，置具塞小锥形瓶中 加浓氨试液 10ml，密塞，浸泡 1 小时，加二氯甲烷40ml，超声处理 1 小时，滤过，滤液蒸 干，残渣加甲醇 o.5mi 使溶解，作为供试品溶液。另取贝母素乙对照品，加甲醇制成每1ml 含 1mg的溶液 . 作为对照品溶液。按薄层色谱法（附录vi b ）试验，吸取供斌品溶液16l 、对照品溶液2l ，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯 - 甲醇 -

7、浓氨试液 - 水(18 ：2：1：0.1) 为展开剂，展开，取出，晾干，依次喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。5.4.3聚合酶链式反应 - 限制性内切酶长度多态性方法。模板 dna提取取本品 0.1 g ，依次用 75 %乙醇 1ml、灭菌超纯水1ml 清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉。取20mg，置 1.5ml 离心管中，用新型广谱植物基因组dna快速提取试剂盒提取 dna：加入缓冲液 ap1 400l和 rna 酶溶液（ 10 mg/ml ）4l，涡旋振荡， 65 水浴加热10 分钟，加入缓冲液ap2 130l，充分混

8、匀，冰浴冷却5 分钟，离心（转速为每分钟14000 转） 10 分钟；吸取上清液转移入另一离心管中，加入1.5 倍体积的缓冲液 ap3/e，混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟13000 转） 1 分钟，弃去过滤液，加入漂洗液 700 l，离心（转速为每分钟12000 转） 30 秒，弃去过滤液；再加入漂洗液500l，离心（转速为每分钟 12000转） 30秒，弃去过滤液；再离心（转速为每分钟13000 转） 2 分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入50l洗脱缓冲液，室温放置3 5 分钟，离心（转速为每分钟12000 转） 1 分钟，将洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2 分钟，离心（转速为

9、每分钟12000 转） 1 分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置 4冰箱中备用。另取川贝母对照药材0.1 g ，同法制成对照药材模板dna溶液。pcr-rflp反应;.鉴别引物： 5cgtaacaaggtttccgtaggtgaa3和5gctacgttcttcatcgat3。pcr 反应体系：在200 l 离心管中进行，反应总体积为30 l，反应体系包括 10 pcr 缓冲液 3 l，二氯化镁（25 mmol/l ）2.4 l，dntp（10 mmol/l ）0.6 l，鉴别引物（30 mol/l ）各0.5 l，高保真 taq dan 聚合酶（ 5 u/ l）0.2 l，模板1l，无菌超纯水2

10、1.8 l。将离心管置 pcr 仪， pcr反应参数： 95预变性4 分钟，循环反应30 次（95 30 秒， 5558 30秒， 72 30 秒）， 72 延伸 5 分钟。取 pcr反应液，置500 l离心管中，进行酶切反应，反应总体积为20 l，反应体系包括 10 酶切缓冲液 2 l，pcr反应液 6 l，sma i （10 u/ l）0.5 l，无菌超纯水11.5 l，酶切反应在 30 水浴反应 2 小时。另取无菌超纯水，同法上述 pcr-rflp反应操作，作为空白对照。电泳检测照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.5 % ，胶中加入核酸凝胶染色剂gelrad，供试品与对照药材酶切反应液的上样

11、量分别为8ldna，dna分子标记上样量为1 l（0.5 g/ l）。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100250 bp 应有两条 dna条带，空白对照无条带。6 检查6.1 水分：按水分测定法标准操作规程（sop-qc-zj-6020）烘干法测定，不得过15.0%。6.1.1 仪器：鼓风电热恒温干燥箱、电子天平。6.1.2 操作方法：接通电子天平电源，启动电子天平，使电子天平预热30 分钟。取洁净的称量瓶，置烘箱内100 105干燥 2 小时，取出，置干燥器中室温放置30 分钟，精密称定重量，再置烘箱内100

12、105干燥 1 小时，取出置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，直至连续两次干燥后称重的差异在0.3mg 以下为止。取供试品最;.粗粉 25g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm。精密称定，记录数据，打开瓶盖在100105干燥 5 小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30 分钟，精密称定，再在上述温度干燥1 小时 ，冷却，称重，并记录数据，至连续两次称重的差异不超过 5mg为止。根据减失的重量，计算出供试品中含水量(%)。（干燥前样品称量瓶）（干燥后样品称量瓶）水分 %-100%（干燥前样品称量瓶）- 称量瓶6.2 总灰分：按灰分测定法标准操作规程（ sop-qc-zj-60

13、16)总灰分测定法测定，不得过 5.0%。6.2.1仪器：节能电阻炉、电子天平、坩锅。6.2.2操作方法：接通电子天平电源，启动电子天平，使电子天平预热30 分钟。取洁净的坩埚，置节能电阻炉内，将坩埚盖斜盖于坩埚上，经加热至600炽灼约 1 小时，停止加热，待节能电阻炉温度冷却至约300，取出坩埚，置干燥器内，盖好坩埚盖，放冷至室温，精密称定重量，再以同样条件重复操作，直至连续两次干燥后称重的差异在 0.3mg 以下为止。取能通过二号筛并混合均匀的粉末23g，置炽灼至恒重的坩埚中，在电子天平上精密称定，放入节能电阻炉内，缓缓炽热，至完全炭化呈黑色，逐渐升高温度至500 600，停止加热，待节能

14、电阻炉温度冷却至约300，取出观察 ，直至完全灰化，取出坩埚，置干燥器内，盖好坩埚盖，放冷至室温，精密称定重量，再以同样条件重复操作，直至连续两次炽灼后称重的差异在0.3mg 以下为止。并记录数据。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量。（灰分坩埚）- 空坩埚总灰分 %100%（样品坩埚）- 空坩埚6.3浸出物：按浸出物测定法标准操作规程（sop-qc-zj-6015）项下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于9.0%。6.3.1仪器：鼓风电热恒温干燥箱、电子天平、电子恒温水浴锅。6.3.2试剂：稀乙醇：取乙醇53ml，加水制成 100ml 即得。;.6.3.3 操作方法：接通电子天平电源，启

15、动电子天平，使电子天平预热30 分钟。取洁净的蒸发皿，置烘箱内 100 105干燥 1 小时，取出，置干燥器中室温放置 30分钟，精密称定重量，再置烘箱内 100105干燥 1 小时，取出置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，直至连续两次干燥后称重的差异在0.3mg 以下为止。 取能通过二号筛并混合均匀的供试品约 4g，置 250ml 的锥形瓶中，精密加稀乙醇100ml，密塞，称定重量，静置 1 小时后连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸

16、干后，于100 105干燥 3 小时 ，置干燥器中冷却30 分钟，迅速精密称定重量。并记录数据。除另有规定外，以干燥品计算供试品浸出物的含量。（浸出物 蒸发皿)蒸发皿 100浸出物 %100%供试品重量 （1水分 %） 256.4 二氧化硫残留量：按二氧化硫残留量测定法标准操作规程（sop-qc-zj-6062）测定，不得过 150mg/kg。6.4.1 仪器： so2 测定装置（ 1000ml）、电热套、 10ml 棕色滴定管、 250ml 锥形瓶、磁力搅拌器、 100ml 量筒。6.4.2试液6mol/l 盐酸溶液：取盐酸54ml，置100ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。淀粉指示液：本液应

17、临用新制。取可溶性淀粉 0.5g ，加水 5ml 搅匀后，缓慢倾入100ml 沸水中，随加随搅拌继续煮沸2 分钟，放冷，倾取上层清液，即得。0.01mol/l 碘滴定液：6.4.3仪器装置：a 为 1000ml 两颈圆底烧瓶； b 为竖式回流冷凝管； c 为（带刻度 ) 分液漏斗；d 为连接氮气流入口； e 为二氧化硫气体导出口；;.6.4.4操作方法：取药材细粉约 10g，精密称定 w，置两颈圆底烧瓶中，加水 300 400ml（应加水至没过氮气导气管的下端），取6mol/l 盐酸溶液 10ml 加入带刻度分液漏斗中。锥形瓶里加入水 125ml 和淀粉指示液 1ml 作为吸收液，置于磁力搅拌

18、器上不断搅拌。打开冷凝管，将冷凝管的上端口处连接一橡胶导气管置于锥形瓶内液面以下。连接导气管入口。开通氮气，调节适宜的气体流量（氮气流速约为0.2l/min, 至蒸馏瓶内有气泡均匀排出）。打开带刻度分液漏斗的活塞，使盐酸溶液10ml 流入烧瓶中。给两颈烧瓶内的溶液加热至沸，并保持微沸约3 分钟后开始用碘滴定液（0.01mol/l ）滴定，吸收液置于磁力搅拌器上不断搅拌，至吸收液显蓝色或蓝紫色持续30 秒钟不完全消褪，记录样品消耗滴定液体积a；并用空白试验校正，记录消耗滴定液体积b。每 1ml 的碘滴定液（ 0.01mol/l ）相当于 0.6406mg 的 so2。c为碘滴定液浓度的校正因子供

19、试品中二氧化硫残留 量 mg/kg( a b) c 100 0.64061000w7 含量测定 ：按紫外 - 可见分光光度法标准操作规程（ sop-qc-zj-6035）测定。7.1 仪器：分光光度计、电子天平、电子恒温水浴锅。7.2 试剂：三氯甲烷、甲醇试液0.05溴甲酚绿缓冲液：取溴甲酚绿0.05g，置 100ml 容量瓶中，加入0.2mol/l 氢氧化钠溶液 6ml，振摇使溶解，加磷酸二氢钾1g，加水使溶解并稀释至刻度，即得7.3 对照品：西贝母碱对照品7.4操作方法对照品溶液的制备精密称取 西贝母碱对照品5mg，置 25ml 棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，制成浓度为c 对（每 1ml 含 0.2mg）的溶液，即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4m1、0.6ml、1.0ml，置25ml 具塞刻度试管中，分别补加三氯甲烷至10.0ml，再用大肚吸管精密加水5ml、再精密加 0.05溴甲酚绿缓冲液2m1，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30 分钟。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以三氯甲烷试剂为空白试剂，按紫外;.- 可见分光光度法标准操作规程（ sop-qc-zj-6035），在 415nm 的波长处测定吸光度，以