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文档简介
1、.川贝母检验标准操作规程文件编码: s0p-qc-zj-3017-03制定部门:质量检验中心题目颁发部门:质量管理部川贝母检验标准操作规程分发部门:质量管理部、质量制定人:日期 :年月日检验中心审核人:日期 :年月日批准人:日期:年月日生效日期 :2012年 10 月 1日变更历史: 1.2003 年 3月制定; 2.2005 年7月执行中国药典 2005年版第一次修订; 3.2010 年 10月执行中国药典 2010年版第二次修订。 4.2012 年10月 1 日执行中国药典 2010年版第一增补本第三次修订。目的:建立川贝母检验标准操作规程。规范检验操作,确保川贝母质量。适用范围:适用于川
2、贝母的检验。责 任 者:质量管理部经理、质检中心主任、质量检验员。内容:1 品名:川贝母2 取样:按药材和饮片取样标准操作规程( sop-qc-zj-6065)取样3 检验依据:川贝母内控质量标准( stp-qs-zj-3015)4 性状松贝 取本品,置明亮处用肉眼观察,呈类圆锥形或近球型 ,尺量,高 0.30.8cm,直径 0.30.9cm。,表面类白色。外层鳞叶 2 瓣,大小悬殊,大瓣紧抱小瓣,未抱部分呈新月形,习称“怀中抱月”;顶部闭合,内有类圆形,顶端稍尖的心芽和小鳞叶 12 枚;先端钝圆或稍尖,微凹入,中心有 1 灰褐色的鳞茎盘,偶有残存须根。质硬而脆,断面白色,富粉性。气微,味微苦
3、。青贝 呈类扁球形,高 0.41.4cm,直径 0.41.6cm。外层鳞叶 2 瓣,大小相近,相对抱合,顶部开裂,内有心芽和小鳞叶 23 枚及细圆柱形的残茎。炉贝 呈长圆形,高 0.72.5cm,直径 0.52.5cm。表面类白色或浅棕黄色,有的具棕色斑点。外层鳞叶 2 瓣,大小相近,顶部开裂而略尖,基部稍尖或较钝。;.5 鉴别:5.1仪器:显微镜、超声波清洗机、电子恒温水浴锅、薄层喷雾气压泵、电子天平5.2试剂与试液5.2.1试剂:二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、浓氨试液5.2.2 试液水合氯醛试液:取水合氯醛50g,加水 15ml 与甘油 10ml 使溶解,即得。甘油乙醇试液:取甘油、稀乙醇各1
4、 份,混合,即得。碘化钾溶液:取碘化钾16.5g ,加水使溶解成100ml,即得。临用新制。稀碘化铋钾试液:取次硝酸铋0.85g ,加冰醋酸 10ml 与水 40ml 溶解后,即得。临用前取5ml ,加碘化钾溶液(4 10) 5ml ,再加冰醋酸20ml,加水稀释至100ml,即得。亚硝酸钠乙醇试液:取亚硝酸钠1g,加乙醇使溶解成100ml,即得。5.3 对照品与:贝母辛对照品、贝母素乙对照品5.4 操作方法5.4.1按显微鉴别法标准操作规程(sop-qc-zj-6034)检查。松贝、青贝、取本品粉末 10g,过四号筛,平铺于洁净的白纸上,在明亮处用肉眼观察,本品粉末类白色。挑取少许置载玻片上
5、,滴加水合氯醛试液2 滴,将载玻片置酒精灯火焰上方 2cm处往返摆动加热至边缘起小泡,即停止加热,补充试液后再加热,直至透化完全。透化后放冷,加甘油乙醇2 滴,盖上盖玻片。置显微镜下观察,淀粉粒甚多,广卵形、长圆形或不规则圆形,有的边缘不平整或略作分枝状,直径564m,脐点短缝状、点状、人字状或马蹄状,层纹隐约可见。表皮细胞类长方形,垂周壁微波状弯曲,偶见不定式气孔,圆形或扁圆形。螺纹导管直径526m。炉贝取本品粉末 10g,过四号筛,平铺于洁净的白纸上,在明亮处用肉眼观察,本品粉末类白色。挑取少许置载玻片上,滴加水合氯醛试液2 滴,将载玻片置酒精灯火焰上方 2cm处往返摆动加热至边缘起小泡,
6、即停止加热,补充试液后再加热,直至;.透化完全。透化后放冷,加甘油乙醇2 滴,盖上盖玻片。置显微镜下观察,淀粉粒广卵形、贝壳形、肾形或椭圆形,直径约至60m,脐点人字状,星状或点状,层纹明显。5.4.2取本品粉末 10g,置具塞小锥形瓶中 加浓氨试液 10ml,密塞,浸泡 1 小时,加二氯甲烷40ml,超声处理 1 小时,滤过,滤液蒸 干,残渣加甲醇 o.5mi 使溶解,作为供试品溶液。另取贝母素乙对照品,加甲醇制成每1ml 含 1mg的溶液 . 作为对照品溶液。按薄层色谱法(附录vi b )试验,吸取供斌品溶液16l 、对照品溶液2l ,分别点于同一硅胶g薄层板上,以乙酸乙酯 - 甲醇 -
7、浓氨试液 - 水(18 :2:1:0.1) 为展开剂,展开,取出,晾干,依次喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。5.4.3聚合酶链式反应 - 限制性内切酶长度多态性方法。模板 dna提取取本品 0.1 g ,依次用 75 %乙醇 1ml、灭菌超纯水1ml 清洗,吸干表面水分,置乳钵中研磨成极细粉。取20mg,置 1.5ml 离心管中,用新型广谱植物基因组dna快速提取试剂盒提取 dna:加入缓冲液 ap1 400l和 rna 酶溶液( 10 mg/ml )4l,涡旋振荡, 65 水浴加热10 分钟,加入缓冲液ap2 130l,充分混
8、匀,冰浴冷却5 分钟,离心(转速为每分钟14000 转) 10 分钟;吸取上清液转移入另一离心管中,加入1.5 倍体积的缓冲液 ap3/e,混匀,加到吸附柱上,离心(转速为每分钟13000 转) 1 分钟,弃去过滤液,加入漂洗液 700 l,离心(转速为每分钟12000 转) 30 秒,弃去过滤液;再加入漂洗液500l,离心(转速为每分钟 12000转) 30秒,弃去过滤液;再离心(转速为每分钟13000 转) 2 分钟,取出吸附柱,放入另一离心管中,加入50l洗脱缓冲液,室温放置3 5 分钟,离心(转速为每分钟12000 转) 1 分钟,将洗脱液再加入吸附柱中,室温放置2 分钟,离心(转速为
9、每分钟12000 转) 1 分钟,取洗脱液,作为供试品溶液,置 4冰箱中备用。另取川贝母对照药材0.1 g ,同法制成对照药材模板dna溶液。pcr-rflp反应;.鉴别引物: 5cgtaacaaggtttccgtaggtgaa3和5gctacgttcttcatcgat3。pcr 反应体系:在200 l 离心管中进行,反应总体积为30 l,反应体系包括 10 pcr 缓冲液 3 l,二氯化镁(25 mmol/l )2.4 l,dntp(10 mmol/l )0.6 l,鉴别引物(30 mol/l )各0.5 l,高保真 taq dan 聚合酶( 5 u/ l)0.2 l,模板1l,无菌超纯水2
10、1.8 l。将离心管置 pcr 仪, pcr反应参数: 95预变性4 分钟,循环反应30 次(95 30 秒, 5558 30秒, 72 30 秒), 72 延伸 5 分钟。取 pcr反应液,置500 l离心管中,进行酶切反应,反应总体积为20 l,反应体系包括 10 酶切缓冲液 2 l,pcr反应液 6 l,sma i (10 u/ l)0.5 l,无菌超纯水11.5 l,酶切反应在 30 水浴反应 2 小时。另取无菌超纯水,同法上述 pcr-rflp反应操作,作为空白对照。电泳检测照琼脂糖凝胶电泳法,胶浓度为1.5 % ,胶中加入核酸凝胶染色剂gelrad,供试品与对照药材酶切反应液的上样
11、量分别为8ldna,dna分子标记上样量为1 l(0.5 g/ l)。电泳结束后,取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中,在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上,在100250 bp 应有两条 dna条带,空白对照无条带。6 检查6.1 水分:按水分测定法标准操作规程(sop-qc-zj-6020)烘干法测定,不得过15.0%。6.1.1 仪器:鼓风电热恒温干燥箱、电子天平。6.1.2 操作方法:接通电子天平电源,启动电子天平,使电子天平预热30 分钟。取洁净的称量瓶,置烘箱内100 105干燥 2 小时,取出,置干燥器中室温放置30 分钟,精密称定重量,再置烘箱内100
12、105干燥 1 小时,取出置干燥器中室温放置30分钟,精密称定重量,直至连续两次干燥后称重的差异在0.3mg 以下为止。取供试品最;.粗粉 25g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中,厚度不超过5mm。精密称定,记录数据,打开瓶盖在100105干燥 5 小时,将瓶盖盖好,移置干燥器中,冷却30 分钟,精密称定,再在上述温度干燥1 小时 ,冷却,称重,并记录数据,至连续两次称重的差异不超过 5mg为止。根据减失的重量,计算出供试品中含水量(%)。(干燥前样品称量瓶)(干燥后样品称量瓶)水分 %-100%(干燥前样品称量瓶)- 称量瓶6.2 总灰分:按灰分测定法标准操作规程( sop-qc-zj-60
13、16)总灰分测定法测定,不得过 5.0%。6.2.1仪器:节能电阻炉、电子天平、坩锅。6.2.2操作方法:接通电子天平电源,启动电子天平,使电子天平预热30 分钟。取洁净的坩埚,置节能电阻炉内,将坩埚盖斜盖于坩埚上,经加热至600炽灼约 1 小时,停止加热,待节能电阻炉温度冷却至约300,取出坩埚,置干燥器内,盖好坩埚盖,放冷至室温,精密称定重量,再以同样条件重复操作,直至连续两次干燥后称重的差异在 0.3mg 以下为止。取能通过二号筛并混合均匀的粉末23g,置炽灼至恒重的坩埚中,在电子天平上精密称定,放入节能电阻炉内,缓缓炽热,至完全炭化呈黑色,逐渐升高温度至500 600,停止加热,待节能
14、电阻炉温度冷却至约300,取出观察 ,直至完全灰化,取出坩埚,置干燥器内,盖好坩埚盖,放冷至室温,精密称定重量,再以同样条件重复操作,直至连续两次炽灼后称重的差异在0.3mg 以下为止。并记录数据。根据残渣重量,计算供试品中总灰分的含量。(灰分坩埚)- 空坩埚总灰分 %100%(样品坩埚)- 空坩埚6.3浸出物:按浸出物测定法标准操作规程(sop-qc-zj-6015)项下的热浸法测定,用稀乙醇作溶剂,不得少于9.0%。6.3.1仪器:鼓风电热恒温干燥箱、电子天平、电子恒温水浴锅。6.3.2试剂:稀乙醇:取乙醇53ml,加水制成 100ml 即得。;.6.3.3 操作方法:接通电子天平电源,启
15、动电子天平,使电子天平预热30 分钟。取洁净的蒸发皿,置烘箱内 100 105干燥 1 小时,取出,置干燥器中室温放置 30分钟,精密称定重量,再置烘箱内 100105干燥 1 小时,取出置干燥器中室温放置30分钟,精密称定重量,直至连续两次干燥后称重的差异在0.3mg 以下为止。 取能通过二号筛并混合均匀的供试品约 4g,置 250ml 的锥形瓶中,精密加稀乙醇100ml,密塞,称定重量,静置 1 小时后连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1 小时。放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,用干燥滤器滤过,精密量取滤液25ml,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸
16、干后,于100 105干燥 3 小时 ,置干燥器中冷却30 分钟,迅速精密称定重量。并记录数据。除另有规定外,以干燥品计算供试品浸出物的含量。(浸出物 蒸发皿)蒸发皿 100浸出物 %100%供试品重量 (1水分 %) 256.4 二氧化硫残留量:按二氧化硫残留量测定法标准操作规程(sop-qc-zj-6062)测定,不得过 150mg/kg。6.4.1 仪器: so2 测定装置( 1000ml)、电热套、 10ml 棕色滴定管、 250ml 锥形瓶、磁力搅拌器、 100ml 量筒。6.4.2试液6mol/l 盐酸溶液:取盐酸54ml,置100ml 量瓶中,加水至刻度,摇匀。淀粉指示液:本液应
17、临用新制。取可溶性淀粉 0.5g ,加水 5ml 搅匀后,缓慢倾入100ml 沸水中,随加随搅拌继续煮沸2 分钟,放冷,倾取上层清液,即得。0.01mol/l 碘滴定液:6.4.3仪器装置:a 为 1000ml 两颈圆底烧瓶; b 为竖式回流冷凝管; c 为(带刻度 ) 分液漏斗;d 为连接氮气流入口; e 为二氧化硫气体导出口;;.6.4.4操作方法:取药材细粉约 10g,精密称定 w,置两颈圆底烧瓶中,加水 300 400ml(应加水至没过氮气导气管的下端),取6mol/l 盐酸溶液 10ml 加入带刻度分液漏斗中。锥形瓶里加入水 125ml 和淀粉指示液 1ml 作为吸收液,置于磁力搅拌
18、器上不断搅拌。打开冷凝管,将冷凝管的上端口处连接一橡胶导气管置于锥形瓶内液面以下。连接导气管入口。开通氮气,调节适宜的气体流量(氮气流速约为0.2l/min, 至蒸馏瓶内有气泡均匀排出)。打开带刻度分液漏斗的活塞,使盐酸溶液10ml 流入烧瓶中。给两颈烧瓶内的溶液加热至沸,并保持微沸约3 分钟后开始用碘滴定液(0.01mol/l )滴定,吸收液置于磁力搅拌器上不断搅拌,至吸收液显蓝色或蓝紫色持续30 秒钟不完全消褪,记录样品消耗滴定液体积a;并用空白试验校正,记录消耗滴定液体积b。每 1ml 的碘滴定液( 0.01mol/l )相当于 0.6406mg 的 so2。c为碘滴定液浓度的校正因子供
19、试品中二氧化硫残留 量 mg/kg( a b) c 100 0.64061000w7 含量测定 :按紫外 - 可见分光光度法标准操作规程( sop-qc-zj-6035)测定。7.1 仪器:分光光度计、电子天平、电子恒温水浴锅。7.2 试剂:三氯甲烷、甲醇试液0.05溴甲酚绿缓冲液:取溴甲酚绿0.05g,置 100ml 容量瓶中,加入0.2mol/l 氢氧化钠溶液 6ml,振摇使溶解,加磷酸二氢钾1g,加水使溶解并稀释至刻度,即得7.3 对照品:西贝母碱对照品7.4操作方法对照品溶液的制备精密称取 西贝母碱对照品5mg,置 25ml 棕色量瓶中,加三氯甲烷溶解并稀释至刻度,制成浓度为c 对(每 1ml 含 0.2mg)的溶液,即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4m1、0.6ml、1.0ml,置25ml 具塞刻度试管中,分别补加三氯甲烷至10.0ml,再用大肚吸管精密加水5ml、再精密加 0.05溴甲酚绿缓冲液2m1,密塞,剧烈振摇,转移至分液漏斗中,放置30 分钟。取三氯甲烷液,用干燥滤纸滤过,取续滤液,以三氯甲烷试剂为空白试剂,按紫外;.- 可见分光光度法标准操作规程( sop-qc-zj-6035),在 415nm 的波长处测定吸光度,以
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