量子点在生物和生物医学的研究.ppt

1、量子点在生物和生物医学上的研究进展及现状,组员：陈华龙 杜俊秋 李密,量子点概述,量子点（quantum dots,QDs）又称半导体纳米微晶，是一种半径小于或接近激子波尔半径，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米材料。当其降到一定的临界尺寸后，电子在三维上的运动受到限制，表现出量子限域效应。 量子限域效应导致费米能级附近的电子能及由连续变为离散能级或能隙变宽，具有类似分子特性的分立能级结构，受激后可发射荧光（右图）。,量子点分类,II-VI族：CdSe,CdTe,ZnS,MgSe等 III-V族：InAs； IV-IV族：SiC,SiGe； IV族：Si,Ge； IV-VI族：PbSe； 单量

2、子点：Au,Gu等,光学特性,宽吸收峰：吸收比其第一发射波长更短的波 较窄的发射峰：荧光发射光谱窄且对称 大的斯托克斯位移：避免发射光谱和激发光谱的重叠，利于信号检测 光学稳定性：抗紫外线，抗光的漂白，抗化学物质，新陈代谢的降解作用 安全性：细胞毒性较小,效率：荧光效率极高，发光时间长，便于跟踪及重复试验（见右图） 发射波长可调性：通过量子点尺寸和组成的调整可以做到同时多组分检测（见下图）,上图e第一组为量子点，第二组为有机荧光,量子点的应用,表面改性及生物功能化 荧光生物标记分析 作为造影剂的生物成像技术 生物芯片 生物传感器,（1）表面改性及合成,有机合成CdSe 量子点步骤为双甲基镉和硒

3、开始以特定的比例（通常摩尔比1.4:1.0）溶解在有机溶剂三正辛基中，并且加入三正辛基氧化物（TOPO,350）作为协调剂，Ar气氛保护。快速降温以防止量子点进一步长大。 要使用生物量子点，需在其外覆盖ZnS或者CdS，以提高其荧光产率和保证量子点不被氧化，最大程度的降低毒性和耐光性。,合成量子点的改善途径,量大，高效率，窄的荧光全半高宽是研究者制备量子点的研究方向之一。之前的方法合成的量子点是非极性（即疏水）的，存在生物不相容性。解决的方法是采用化学交换法改变表面化学特性，即双功能试剂（如巯基酸）与表面金属离子配合。例如巯基（MAA中的）与膦氧化物（TOPO中的）结合，绑定到金属原子上。如果

4、双功能分子中还有极性官能团，量子点将变得高度极性并且易溶于水溶剂。 缺点是絮凝现象和产量下降。,表面修饰有三正辛基氧化磷（TOPO）的量子点先与双亲聚合物的疏水长链以疏水作用力相互结合，再通过疏水基团的亲水集团与生物分子连接。另外对量子点表面进行硅烷化,处理，嵌入可以与生物分子连接的官能团。,（2）量子点的生物荧光标记应用,量子点的应用可以补充现有的有机荧光技术。利用细胞标记量子点能够做到： 跟踪细胞迁移 原位杂交 全动物造影剂 病原体检测 基因组和蛋白质组的检测 荧光共振能量转移传感器（FRET） 高通量筛选的生物分子 以上都可以说明量子点可以广泛的作为一种实用的工具。,在细胞中，量子点可以

5、用颜色标记生物分子，而且由于他们的亮度和光化学稳定性，使得他们能够成像并且能监测很长一段时间。 但是，目前限制量子点的因素还有很多，比如量子点的供应不足，非特异性结合降低了检测灵敏度，仪器的限制。目前已有多家公司提供量子点，有至少8种颜色量子点可购得。用聚乙二醇涂层非特异性结合到量子点上，以降低其非与生物的非特异性结合。CCD相机的可识别范围增大，也为提高量子点的灵敏度提供了可能。,量子点已成为临床医学上鉴别某些生物标志的重要生物技术手段。 Goldman等人用四种不同颜色的量子点分别于康霍乱毒素、蓖麻毒素、志和菌毒素1和葡萄球菌肠毒素B的抗体偶联，在一个微孔板上实现四种毒素的同时检测。,荧光

6、共振能量转移（FRET）,当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子） 的激发光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。 此种现象即称为荧光共振能量转移（FRET）。,荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100A0），就可观察到荧光能量,由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。 发生条件 能量供给体接受体（DA）

7、对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括： 能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠； 能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列； 能量供体、能量受体之间必须足够接近。此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。,高通量筛选生物分子,Nie等人巧妙地将不同数量的不同荧光特征的量子点组合进内部镂空的高分子小球，从而形成具有不同光谱特征和亮度特征的可标记到生物分子上的球，发现将56种颜色，6种发光强度的量子点进行不同组合即可形成10000-40000种可识别编码的量子点微球，如果发光强度的变化增加到lO种，就可以加工出100万种

8、可识别的编码微球，理论上可以对100万种不同的DNA或蛋白质进行识别。 量子点技术与芯片技术结合可以实现超高通量筛选。芯片上有海量的蛋白质，但是受到目前有机荧光染料的限制，一次通常只能将一种（或很少几种)标记了荧光探针的蛋白质与芯片作用，要研究多个蛋白质,就只能重复上述操作。如果在研究中引入量子点编码微球标记物就可以做到“海量”对“海量”，用同一波长的光激发，同时检测所有标记的蛋白质与芯片上的蛋白质之间的相互作用，与现有的方法相比，效率会大大提高。下图为复合荧光微粒的透射电镜照片，每个微球中心含一个CdTe量子点。,（3）QDs活体成像,对于活体成像，研究和开发荧光发射波长在700nm2 00

9、0 am的荧光探针意义特别重大。因为在这个范围的近红外光在生物组织内具有低吸收和散射的特点，从而可以获得较大的穿透深度。遗憾的是CdSe和CdTe等近红外量子点的荧光发射效率经过生物相容性的表面修饰后，量子效率降低至17，同时荧光发射峰变宽，且光稳定性能较可见光范围的量子点差。抗体虽然对生物分子具有较高的亲合力，但它将很大程度上增大了量子点的尺寸大小(5 nm30 nm)，而且还限制了其它聚合体的应用。 目前用于活体成像的量子点的研究资料还不多，对于其走向临床还存在很多的挑战。,问题及挑战,基于存在的挑战必须解决以下问题： 体内成像量子点的最佳剂量的是多少？ 什么是体内量子点动力学？ 如何防止

10、量子点被网状内皮细胞吸收？ 这些量子点对动物是否有毒？,对于量子点最佳剂量，有报告称在1nmol到30nmol. 量子点的动力学研究还没有得到彻底的调查，只有极少数的定量测量报告。 网状内皮系统（RES）是人体具有防御机制的机构，可以吸收量子点。如果量子点被吸收，则不能到达目标地，量子点的利用效率降低。目前的一个解决方案是在量子点外覆PEG表面涂层。,量子点的细胞毒性,由于量子点含有cd2+和se2+等重金属毒性离子，而这些金属离子对肺和肾脏都具有毒性。量子点的细胞毒性作用还是一个亟待解答的问题。 在氧化和紫外光的辐照下，量子点的毒性与其浓度和表面修饰相关。量子点进行光氧化，释放金属离子，造成

11、细胞的死亡。Shiohara等也通过实验验证了量子点毒性与其浓度剂量有关的结论，同时他还指出毒性与细胞类型有关。此外，量子点的毒性还与其所在生物微环境下的氧化、光分解和合成稳定性等因素密切相关。 另外，表面涂层对量子点对细胞的毒性作用的改善也应该得到重视。虽然这些都是体外实验提供的数据，但对体内毒性评估也具有很大的参考价值。,量子点的间歇闪烁行为,量子点始终处于发射态或者非发射态，两者之间随机转换，这种“闪烁”行为在单个量子点荧光发射中特别明显。随着量子点的持续激发，量子点发射的荧光强度也随着增强，称作“光变亮”效应。虽然在生物学的应用中可能不是一个缺陷，但在定量实验研究中是一个尚待解决的问题

12、，截至目前还没有得到彻底的解决。,量子点的生物成像研究,吴等人将CdSe/ZnS与羊抗鼠IgG或链霉素结合，并将其作为单体克隆抗体进行免疫反应，从而实现了乳腺癌细胞的特异性检测。,（a）PEG-coated CdSe/ZnS量子点标记的小鼠肺部：血管、肿瘤细胞、肿瘤中的血管和淋巴管 （b）近红外荧光量子点被前哨淋巴结吸收,活体成像,C.包含各种量子点的不同颜色的微珠被注射到小鼠体内用于活体成像 D.用连接有抗体的红色量子点进行小鼠活体内前列腺癌细胞的特异性标记和成像。,（4）生物芯片技术,量子点色彩的多样性满足了对生物高分子（蛋白质、DNA）所蕴含海量信息的分析要求。,将聚合物和量子点结合形成

13、聚合物微珠，微珠携带不同尺寸（即不同颜色）的量子点，被照射后开始发光，经棱镜折射后传出，形成几种指定密度的谱线（条形码），这种条形码在基因芯片和蛋白质芯片技术中有着光明的前景。,（5）生物传感器,CdSe/ZnS与有机磷水解蛋白（OPH）通过静电作用偶联，测定对氧磷。,量子点在生物传感器方面的研究是以量子点作为能量供体，以有机荧光染料作为能量受体。 例：两步能量转移糖类传感器,为了增大能量转移效率，在供、受体之间插入Cy3,作为能量转移桥梁（如左图箭头处）。,量子点应用于DNA生物传感器,目前量子点在DNA生物传感器研究中的应用主要是以下两方面： 1)提高固载的DNA量 量子点引入电极表面后，

14、增大了电极表面有效面积，提高了电极灵敏度 2)作为电化学标记物,对电化学检测信号起到增强和放大的作用，除了能作为荧光标记物外，亦能作为电化学的标记物。,展望,制备大量的，具有生物相容性的，荧光效率高的量子点仍然具有很大的发展空间 生物特异性标记检测技术不断进步。 量子点细胞毒性及其剂量大小亟待研究 量子点活体深层成像技术有待进一步提高 生物系统量子点的基础研究必须加强 量子点将会与生物纳米技术不断融合 将纳米结构的分析纳入到设备中，使其具有多路复用功能,参考文献,1 Wu X, Liu H, Liu J, Nat Biotechnol,2003,21(1):41-46. 2 Kim S, lim YT, Soltesz EG. Nat Biotechnol,2004,22:94-97. 3 X Gao, M L.Richard, Shuming Nie. Nat Biotechnol,2004,22:959-960. 4 Goldman E R, Clapp A R, Anderson G P. AnaL Chem,2004,76(3):684. 5 Jesse M. Klostranec ,Warren C. W. Chan. Quantum Dots in Biologic