第五章 目的基因的获取、扩增与检测及相关技术-之3检测-zhl2-已修.ppt

1、第五章 目的基因的获取、扩增 与检测及相关技术,1、物理化学方法 2、鸟枪法 3、化学合成法 4、基因文库 5、逆转录合成 6、 PCR技术 7、凝胶电泳 8、酵母双杂交系统 9、杂交技术 10、生物芯片 11、 DNA测序,基因的获得,基因的扩增,基因的检测,第三节 目的基因的检测技术,一、凝胶电泳 二、 PCR技术 三、杂交技术 四、DNA测序 五、酵母双杂交系统 六、生物芯片,一、凝胶电泳（已讲） 二、 PCR技术（已讲）,核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washin

2、gton）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,三、杂交技术,1、原理 2、分类 3、杂交过程,三、杂交技术,1、原理,（1）核酸分子间杂交 ： 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 （2）蛋白质间杂交： 抗原-抗体免疫反应,复性,RNA,DNA,靶蛋白（抗原）,抗体,抗抗体,（1） Souther

3、n印迹杂交 (Southern blotting) DNA-DNA,（2） Northern印迹杂交 (Northern blotting) RNA-DNA,（3） Western印迹杂交 (Western blotting) 蛋白质-蛋白质,2、分类,（4）菌落原位杂交 (in situ hybridization) DNA-菌落DNA, 核酸杂交： （基于碱基互补配对） 蛋白质杂交：Western杂交,Southern杂交 Northern杂交 菌落原位杂交,其他： 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization) DNA-染色体DNA 斑点杂交(印迹) (dot

4、blotting) DNA-DNA(直接点样杂交) DNA点阵、生物芯片,DNA点阵,（1） Southern印迹杂交,（2） Northern印迹杂交,（3） Western印迹杂交,3、杂交过程,（4）菌落原位杂交,* 是E.Southern 于1975年创建用以鉴定DNA中某一特定的基因片段的技术，也称为Southern印迹（Southern Blotting）。 * 通过标记的探针DNA与靶DNA结合，检测目的基因的存在及大小。,（1）Southern杂交,探针（probes）:根据所需基因的核苷酸顺序制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记,Southern印迹法,DNA分子,限

5、制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,Southern 凝胶转移杂交技术,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,放射自显

6、影照片,（2）Northern杂交,* 也称为Northern印迹（Northern Blotting），用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。 * 因与DNA的杂交（Southern 杂交）相对应，故被趣称为Northern杂交。,（3）Western(印迹)杂交,* 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。 * 与DNA、RNA水平上的Southern杂交、Northern杂交相对应，称为Western杂交。 * 常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控。,Southe

7、rn和Western印迹法,DNA frangment,Electrophoresis,Transfer of DNA by blotting,32P-labled DNA probe,Autoradiography,Agarrose gel,Autoradiogram,Nitrocellulose sheet,Autoradiogram,Polymer sheet,SDS-Polyacrylamide gel,Transfer protein,Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody,Protein b

8、and detected by specific antibody,Autoradiography,三种印迹技术的比较,（4）菌落原位杂交,* 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 * 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。,菌落杂交 也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。 鉴定重组子。,原位杂交法筛选DNA重组体图解,复印至硝酸纤维素膜上,用NaOH菌体裂解DNA变性,杂交,放射自显影,32P-cDNA,与放射性cDNA杂交的菌落的斑点,细菌菌落,单链DNA结合到膜上,检测重组

9、体克隆的菌落杂交技术,菌落原位杂交,第一节 分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology,探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,杂种核酸分子： 彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。 DNA/DNA的杂交作用 检测特定生物有机体之间的亲源关系 DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。,核酸杂交常用几种膜的性能比较,硝酸纤维素膜 不能滞留小于150bp的DNA片断，不

10、能同RNA结合。 应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。 RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。,尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤： 1. 核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用 2. 印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。,1、 Southern(萨瑟恩)DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.S

11、outhern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。,印迹转移前的凝胶处理： 分子量不同所需转移的时间不同； 浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤，再进行碱变性 碱水解，DNA链断裂 单链,Southern 凝胶转移杂交技术,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的

12、阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,在进行核酸印迹转移的时， 1. 要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤12小时； 2. 紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。,2、 Northern(诺赛恩)RNA印迹技术（Northern blotting） 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做Western(韦斯顿)蛋白质杂交技术（Western blotting）。,蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术,凝胶阻滞实验（Gel retardation assay） 又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在