第三章 生物化学检验常用技术.ppt

1、第三章 生物化学检验常用技术,学习目标：,第一节 光谱分析技术,利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量的分析技术,光谱分析技术,灵敏、准确,选择性强,快速、简便,应用范围广,生物化学检验中最基本 和最常用的分析技术,光谱分析技术分类,第一节 光谱分析技术,一、吸收光谱分析法,（一）分光光度法的基本原理 根据Lambert-Beer定律，当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶液浓度成正比,第一节 光谱分析技术,式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度 根据LambertBeer定律，当溶液层厚度单位为1c

2、m，浓度单位为1mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数（） 是物质的特征性常数。在固定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础,第一节 光谱分析技术,应用LambertBeer定律时必须符合3个条件：,二是被测样品必须是均匀介质,应用LambertBeer定律时必须符合3个条件：,三是在吸收过程中，吸收物质之间不能发生相互作用,一是入射光必须为单色光,第一节 光谱分析技术,8,LambertBeer定律的偏离现象：,溶液本身发生化学变化引起的偏离,仪器因素引起的偏离,溶液不是稀溶液时会引起偏离,非单色入射光会引起偏离,光的散射、折射引起的偏离,第一节

3、光谱分析技术,9,样品空白,溶剂空白,不显色空白,平行操作空白,试剂空白,当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色粒子时，选用空白溶剂参比,当样品基体溶液有颜色，而显色剂无颜色且显色剂也不与样品基体显色时，选用样品空白,当显色剂和被测试样均有颜色时，选用不显色空白,与样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品溶液进行平行操作,当显色剂或其它试剂有颜色，而被测试样中又无其他有色粒子时，选用试剂空白参比,第一节 光谱分析技术,10,（二）分光光度法在生化检验中的应用 1.对未知化合物进行定性分析 2.对待测物质进行定量测定 （1）标准曲线法 （2）比较法 （3）其它分析方法,一、吸收

4、光谱分析法,第一节 光谱分析技术,（1）标准曲线法 根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系 待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度,第一节 光谱分析技术,制作和应用标准曲线时应注意下面几点： 当测定条件发生变化时（如更换标准品、更换光电池或光源以及试剂批号不同时），标准曲线应重新绘制 标准品应有高的纯度，标准液的配制必须准确 当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定 标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致 标准溶液设置的浓度范围须足够大，应达到观察拐点,第一节 光谱分析技术,（二）比较法,Cx=(AxCs)/As,己知浓度的标

5、准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：,其中Cx和Ax为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近,（三）其它分析方法 包括差示法、多组分混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法,第一节 光谱分析技术,二、发射光谱分析法,分子、原子或离子在辐射能的作用下，由基态或低能态跃迁到激发态，当它们返回基态或低能态时，以辐射的形式释放出能量，由此而产生的光谱,发射光谱,（一）火焰光度法,（二）荧光分光光度法,第一节 光谱分析技术,15,火

6、焰光度法基本原理：指在一定条件下，以火焰作为激发源提供热能，使样品中待测元素原子化，由于原子能级的变化，产生特征的发射谱线 火焰光度法临床应用：主要用于血清及尿液样品中钠、钾的测定,特征辐射,基态元素M,激发态M*,热能（火焰）,E,第一节 光谱分析技术,荧光光谱基本原理：荧光是分子吸收光能量被激发后，从激发态的最低振动能级跃迁返回基态时所发射出的光,荧光光谱临床应用：大量具有生物意义的物质，都可采用荧光分光光度法进行分析测定，如氨基酸、蛋白质、核酸、酶和辅酶、嘌呤、嘧啶、卟啉、维生素等,第一节 光谱分析技术,17,三、散射光谱分析法,利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量

7、分析的方法,散射光谱分析法,（一）散射比浊法,（二）透射比浊法,第一节 光谱分析技术,18,散射比浊法基本原理：一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时，遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关，光强度与复合物的含量成正比,透射比浊法基本原理：当光线通过一定体积的溶液时，由于溶液中存在颗粒（抗原抗体复合物）对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，透射光的透光率和粒子的量成反比。通过测定透射光的透光率来反映粒子的量的方法即透射比浊法,三、散射光谱分析法,第一节 光谱分析技术,第二节 电化学分析技术,第二节 电化学分析技术,

8、利用物质的电化学性质，测定化学电池的电流、电位、电导、电量等物理量的变化，从而测定物质组成及含量的分析方法,电化学分析技术,灵敏、准确,仪器简单,快速、简便,价格低廉,它是电化学和分析化学学科的重要组成部分,21,第二节 电化学分析技术,22,电位分析法基本原理：利用电极电位和浓度之间的关系来确定物质含量的分析方法，表示电极电位的基本公式是Nernst方程式 电极电位测量：由于单个电极电位的绝对值无法测量，必须将ISE与参比电极共同浸入待测样品中组成一个原电池，通过测量原电池电动势（E电池）来测定EISE值 参比电极：通常为负极，常用的有甘汞电极和银氯化银电极，其电极电位不随测定溶液和浓度变化

9、而变化,一、电位分析法,第二节 电化学分析技术,23,ISE基本结构 电极腔体：玻璃或高分子聚合物材料做成 内参比电极：通常为Ag/AgCl电极 内参比溶液：由氯化物及响应离子的强电解质溶液组成 敏感膜（电极膜）,离子选择性电极分析法(ion selective electrode，ISE)是电位分析法中发展最为迅速、最为活跃的分支,第二节 电化学分析技术,第二节 电化学分析技术,离子选择性电极的分析方法：,第二节 电化学分析技术,直接法指样品不经稀释直接由电极测量离子活度 优点是可采用全血测定，它迅速方便，结果准确，不会因血清中水体积所占比例的改变而影响结果,间接法指样品经一定离子强度缓冲溶

10、液稀释后由电极测量离子活度 优点是样品用量少；由于样品预先进行稀释，不易堵塞管道；降低了血脂、不溶性蛋白质对电极的污染及损耗，使电极的寿命延长,样品测定方法：,第二节 电化学分析技术,离子选择性电极对任何标本的测量，都可能存在离子强度、络合剂及干扰物质的影响，不同的分析方法其影响的大小不同 通常在标准溶液及标本溶液中加入与待测离子无干扰的浓度较大的电解质溶液，作为总离子强度调节缓冲液（total ionic strength adjustment buffer，TISAB） TISAB可保持较大且相对稳定的离子强度，使活度系数恒定；维持溶液在适宜的pH范围内，满足离子电极的要求；还能掩蔽干扰离

11、子,电极分析法的影响因素：,第二节 电化学分析技术,电极分析法在临床检验中的应用电解质分析仪,第二节 电化学分析技术,第二节 电化学分析技术,二、电导分析法,将被分析溶液放在固定面积、固定距离的两个电极所构成的电导池中，通过测定电导池中电解质溶液的电导值来确定物质的含量,电导分析法,检测红细胞压积 红细胞由于其具有脂质双分子层的膜结构而被认为是电的绝缘体,血细胞计数 其原理基于血细胞的电导率低于作为悬浮介质的盐溶液的电导率（“库尔特原理”）,应用,第二节 电化学分析技术,三、电容量分析法,根据滴定过程中电极电位的变化来确定滴定终点的分析方法。滴定过程中，随着滴定剂的加入，发生化学反应，待测离子

12、或与之有关的离子活度（浓度）发生变化，指示电极的电极电位（或电池电动势）也随着发生变化，在化学计量点附近，电位（或电动势）发生突跃，由此确定滴定的终点,电容量分析法,第三节干化学分析技术,第三节干化学分析技术,指将液态样品如血浆、血清、尿液等置于含有试剂的固相载体上发生反应，依照反应结果定量测定样品中特定成分的浓度或活度的一项技术,干化学分析,是一种专门使用固相载体试剂进行临床化学检验的分析仪，它通过反射光度法、差示电位法等方法定量测出样品中特定成分的浓度或活度,干化学分析仪,33,干化学技术普遍采用多层膜固相试剂技术，即干式化学的多层膜试剂载体，它集中现代化学、光学、酶工程学、化学计量学和计

13、算机技术于一体，已使其作为定量方法,一、干化学分析技术的基本原理,第三节干化学分析技术,34,理论基础：遵从Kubelka-Munk理论 光反射率与固相层的厚度、单位厚度的光吸收系数以及固相反应层的散射系数有关系，当固相层厚度和固相反应层的散射系数固定时，光吸收系数同待测物的浓度成正比,（一） 反射光度法,第三节干化学分析技术,35,多层膜干片结构 （1）样本扩散层 （2）反射层 （3）辅助试剂层 （4）试剂层 （5）透明支持层,基于反射光度法的多层膜干片结构示意图,第三节干化学分析技术,基于传统湿化学分析的离子选择电极原理，用于测定无机离子,（二） 差示电位法,多层膜结构 （1）离子选择性敏

14、感膜（2）参比层 （3）氯化银层 （4）银层 （5）支持层,第三节干化学分析技术,37,干化学自动分析仪已广泛应用于检验医学的各个方面，检测的项目已多达70余项，包括常规生化、内分泌激素、毒素、药物浓度分析以及特种蛋白等免疫学检验,二、干化学分析技术在临床检验中的应用,第三节干化学分析技术,38,干化学分析法的特点：,速度快，灵敏度和准确度与典型的分离式仪器相近,应用LambertBeer定律时必须符合3个条件：,超微量，操作简单，占用空间小，使用过程中灵活机动性强,脱离了传统的分析方法，所有的测定参数均存储于仪器的信息磁场块中,第三节干化学分析技术,39,干化学和湿化学生化检测的主要区别,第

15、三节干化学分析技术,40,1.仪器监测 2.校准频度 3.质控物 4.干片试剂的储存与使用 5.工作环境温度和湿度,三、干化学分析技术的影响因素,第三节干化学分析技术,第四节电泳分析技术,第四节电泳分析技术,1937年瑞典的Tiselius创造了Tiselius电泳仪，最早建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法 1950年Durrum用纸电泳进行了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创

16、建了聚丙烯酰胺凝胶电泳 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术 由90年代至今，电流分析仪的最大变化特点为自动化程度日益提高，应用领域大大增加,一、电泳分析技术的基本原理,溶液中带电粒子在电场中定向移动的现象称为电泳,电泳,第四节电泳分析技术,(一) 蛋白质的两性电离及等电点,蛋白质的等电点（pI）： 如果在某一pH值溶液中，蛋白质所带的正负电荷相等，即蛋白质的净电荷为零，蛋白质电离为兼性离子时，该溶液的pH值称为该物质的等电点,粒子的荷电量可以通过调节pH值与pI之间的差值加以控制，差值越大，粒子荷电量越多,第四节电泳分析技术,(二) 电泳迁移率,电泳迁移率是指在单位电场强度时带电粒子的迁移

17、速度,带电粒子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个粒子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离,迁移率与带电粒子所带净电荷成正比，与粒子的大小和缓冲液的黏度成反比,第四节电泳分析技术,血清蛋白等电点和电泳迁移率,第四节电泳分析技术,(三) 影响电泳的因素,第四节电泳分析技术,支持介质的电渗作用,第四节电泳分析技术,二、常用电泳分析技术及应用,第四节电泳分析技术,以醋酸纤维素薄膜作为支持介质的一项电泳技术,以琼脂糖凝胶作为支持介质的一项电泳技术,利用有pH梯度的介质

18、分离等电点不同的蛋白质的电泳技术,以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一项电泳技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,等电聚焦电泳,按电泳 支持物分类,第四节电泳分析技术,二、常用电泳分析技术及应用,1.醋酸纤维素薄膜电泳,优点：醋酸纤维素几乎不带电荷，吸附作用和电渗作用都很微弱；分辨率高，区带清晰；不吸附染料，区带周围染料可完全漂洗干净；极易透明，便于区带扫描定量；透明后的薄膜易于干燥，电泳区带可长期保存,缺点：吸水性较差，较脆，电泳时水分容易蒸发。因此要求电泳槽密闭性能要好，始终维持水蒸气饱和，电流强度不宜过大，一般保持在0.40.6mA/cm宽为宜,第四节电泳分析技术,2

19、.琼脂糖凝胶电泳,优点：琼脂糖凝胶透明度好，便于区带扫描。适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化，在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测,缺点：电泳完毕后区带易扩散，可及时固定,第四节电泳分析技术,3.聚丙烯酰胺凝胶电泳,优点： 1.既有电荷效应又有分子筛效应，分离效果好 2.化学稳定性高，是一种稳定的亲水胶体 3.几乎没有吸附和电渗作用 4.机械强度好，无色透明，可直接光密度扫描 5.可调节凝胶孔径以适合不同分子量的分离,第四节电泳分析技术,4.等电聚焦电泳,是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术,等电聚焦（isoelectric focusing，IEF

20、）,优点： IEF是一种简便、快速、高效的分离分析方法，特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类和抗体等的分离分析，能够满足组分定量、杂质检出、质量控制、临床诊断等方面的要求,第四节电泳分析技术,(三) 电泳区带的测定,第四节电泳分析技术,(三) 电泳区带的测定,1.区带定性分析主要观察有无异常区带出现 2.区带定量分析区带定量分析常用光密度扫描法或洗脱比色法,第四节电泳分析技术,三、自动电泳仪分析技术,自动电泳仪的电泳过程，包括加样迁移染色去色烘干，都依次按程序自动进行,第四节电泳分析技术,第五节 基因扩增技术,第五节 基因扩增技术,聚合酶链反应（PCR）：又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序

21、列体外引物定向酶促扩增法。能使人们在几小时内从试管中获得大量的特异的核酸片段。临床实验室主要用于对病毒、细菌、支原体及其它病原体的检测,一、PCR反应基本原理,2.退火（annealing） 即在较低的温度(4070)下使加入的引物与待扩增的DNA区域特异性结合，以提供DNA复制起始的3-OH端,3.延伸（extension） 即在适当的温度下（7075），DNA聚合酶特异性结合到DNA模板上的引物的3-OH端，以dNTP为反应原料，以靶序列为模板，根据碱基互补配对原则，进行DNA链的延伸，即合成DNA新链,1.变性（denature） 通过加热至95左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成DNA单链模板而游离于反应体系中，此过程称为变性,第五节 基因扩增技术,61,上述3个步骤反复循环，使得特定长度的靶DNA数量呈指数上升。在理论上，终产物DNA的量可用Yn=X2n计算,第五节 基因扩增技术,模板就是被复制的核酸片段,引物是PCR特异性反应的关键，为化学合成的寡核苷酸,可稳定核苷酸和提高Taq DNA聚合酶的活