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1、第九章 动物细胞工程概述,动物细胞工程是以动物细胞为对象，通过工程技术手段对细胞的遗传与生理特性进行改良和修饰，从而获得人类所需要的产物或器官乃至个体的生物技术。 动物细胞工程技术涉及动物组织、细胞以及胚胎操作的相关技术。,动物细胞工程的主要领域及意义,动物细胞特性,动物细胞培养的环境 与营养要求,动物细胞培养技术简述,动物干细胞研究概况,第一节 动物细胞工程的主要领域及意义,单克隆抗体与现代医学,动物胚胎工程与畜牧业,动物细胞规模化培养与现代医药业,动物克隆的有益应用,一. 单克隆抗体技术与现代医学,单克隆抗体技术是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(a

2、ntigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology)。,单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可提高疾病诊断准确性。 单克隆抗体疫苗，可增加疫苗安全性。 单克隆抗体用于某些肿瘤治疗。 单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究。,二. 胚胎工程与畜牧业,利用胚胎技术可以以工厂形式大批量生产优质胚胎，从而可以降低胚胎成本，扩大移植胚的来源，使农畜动物胚胎移植的推广应用成为可

3、能。,体外受精可以准确地确定受精的时间和胚胎发育阶段，因此，利用体外受精技术进行核移植、性别控制和基因导入，可望工厂化生产遗传性稳定、生产性能优良的家畜，以加快农畜良种化。,动物细胞培养的产物,三. 动物细胞规模化培养与现代医药,四. 动物克隆技术的有益应用,动物克隆技术至少在以下几个方面具有广阔的应用前景： 保存优良的动物品种； 拯救濒临灭绝的珍惜动物； 利用克隆动物工厂生产蛋白质药物，发展新型的医药工业； 利用克隆技术生产人体器官，扩大器官移植所需的器官来源。,第二节 培养条件下动物细胞特性,动物细胞 与植物细胞比较,培养条件下 动物细胞生长特性,培养条件下 动物细胞生理特性,一. 动物细

4、胞与植物细胞比较,动物细胞的表面由质膜包被着，质膜控制着细胞内外物质的运输。质膜与细胞内部的膜系统、内质网、高尔基体和核膜等都相联。 植物细胞外面有细胞壁，而细胞之间有一层胶状物即胞间层（middle lamella）将两个细胞粘合在一起，在两个相邻细胞之有胞间连丝（plasmadesma）使细胞间相互流通。,动物细胞的细胞质中溶酶体（lysosomes）较发达，同时还含有许多酶原粒。 而植物细胞中则含有较多的质体(plastid)，包括叶绿体(chloroplast)、白色体（leucoplast）和杂色体(chromoplast)。,在活体内，动物细胞在胚胎期即已高度分化，而且这种分化是不

5、可逆转的。 活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类： 第一类是能保持继续分裂能力的细胞-干细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞； 第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞； 第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。 第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。,二. 培养条件下动物细胞生长特性,离体培养的动物细胞可分为： 贴壁依赖型：包括成纤细胞型、上皮细胞型 非贴壁依赖型：悬浮型细胞，如血液、淋巴组织的细胞 兼性贴壁细胞：如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞,

6、二. 培养条件下动物细胞生长特性,三. 培养条件下动物细胞的生理特点,1. 动物细胞的分裂周期长 动物细胞分裂周期一般为1248小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。,各类细胞分裂周期时间表,2接触抑制(contact inhibition)现象,除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑

7、制或密度依赖抑制现象。,3有限细胞系和永久细胞系,动物细胞离体培养的起始物培养，称为原代培养（primary culture）。,大多数动物细胞继代培养后会转换成有限细胞系和永久细胞系两类,3有限细胞系和永久细胞系,有限细胞系(finite cell line)：即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，经过运动世代后细胞将逐渐死亡。 有限细胞系的存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。,永久细

8、胞系或称连续细胞系：有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)。 永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前体。,3有限细胞系和永久细胞系,4动物细胞的环境敏感性,动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。 动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。 动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。

9、,第三节 动物细胞培养的环境与营养要求,动物细胞培养 的环境要求,动物细胞培养 的营养需求,一. 动物细胞培养的环境要求,1. 温度 温度是细胞体外生存的基本条件之一，来源不同的细胞，其最适生长温度不尽相同 如昆虫细胞培养温度一般是2528 哺乳动物细胞的培养温度一般是37。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳低温细胞在45下只能存活1小时，但在25条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。,2. pH,动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。 培养

10、细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。,3. 溶氧及气体环境,一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。,4. 渗透压,动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题： 一是培养基的渗透压维持； 二细胞体内的渗透压维持。 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。 动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。,二. 动物细胞培养的营养要求,1. 天然培养基 天然

11、培养基是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自于动物体液或从动物组织分离提取，其优点是营养成分丰富、培养效果好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。 天然培养基的种类很多，主要包括生物性体液（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）、水解乳蛋白等。,2. 合成培养基,合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复试验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。这种培养基在很多方面有天然培养基无法比拟的优点，它既能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。,目前用于动物细胞培养的合成培养基种类很

12、多，一般均包含氨基酸、维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分。 尽管各种合成培养基给细胞培养带来极大方便，但许多实验表明，单纯使用合成培养基细胞的贴壁、增殖效果常常不理想。因此，在使用时通常仍然需要加入一定量的动物血清，常用的动物血清有小牛血清、鸡血清等。 常用的人工培养基MEM，DMEM，RPM1640,常用人工合成培养基组成及含量（mg/L）,目前用于动物细胞培养的合成培养基种类很多，一般均包含氨基酸、维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分。大多数合成培养基均已商品化，可直接从生产商,第四节 动物细胞培养技术简述,WI-38 由美国人Hayflick等1961年从一女性高加索人的正常胚肺组织中

13、获得。2n=46，属成纤维细胞，培养基采用BME附加10的小牛血清，是最早被认为可安全传代的细胞系，在20世纪60年代广泛用于制备疫苗。 MRC-5 英国国立医学研究所Jacobs等人1966年从14周的正常男性胚肺组织中获得，2n=46，属成纤维细胞，培养基采用BME附加10的小牛血清。其倍增时间比WI-38短，对不良环境的敏感性比WI-38低，用于生产人体疫苗。,常用克隆细胞系,Namalwa 它是上个世纪70年代由Singh从肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人体中获得，后在瑞典Katolinska研究所建成的一株类淋巴母细胞，该细胞系具有2.8%的高倍体率，多数细胞有12-14条标记染

14、色体，单个X染色体，无Y染色体。培养基采用RPMI1640附加7%的胚牛血清。已被大规模用于生产-干扰素。 SP2/0-Ag14 1978年由瑞士的Shulmam和英国的Wilde等人通过融合方法，从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合的杂交瘤SP2/HL-Ag亚克隆中分离获得。采用DMEM培养基附加10%胚牛血清。广泛用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体生产，近年来正在被开发为生产其它药品的高表达宿主细胞。,Sf-9 1983年由美国植物保护研究所的Smith等人从亲代IPLB-SF21AE中克隆，亲代细胞来自粘虫。培养基为Grace附加3.3gl-

15、1水解乳蛋白、3.3gl-1酵母浸提液和10%胚牛血清。目前被广泛用于高效表达外来蛋白制品。 此外，还有一些特殊用途的细胞系，如用于病毒增殖的Vero细胞系，用于工程细胞系构建的CHO-K1、BHK-21等。,三 动物细胞培养技术简述,1悬浮培养 它适用于非贴壁依赖性细胞，也可用于兼性贴壁细胞。其操作方法与植物细胞悬浮培养相似。 悬浮培养的设备亦包括通气搅拌式和气升式反应器，目前较为成熟的设备产品主要有：英国Wellcome公司的8000L搅拌罐式反应器，他们用于Namalwa培养生产-干扰素。英国Celltech公司的2000L气升式生物反应器，目前他们用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。,三

16、 动物细胞培养技术简述,2贴壁培养,贴壁培养是让细胞贴附于适当基质上进行增殖培养的方法，它适用于一切贴壁依赖性细胞以及兼性贴壁细胞。其优点是可以采用灌流式操作方式使细胞目的大大提高，但操作比较复杂，规模放大培养比较困难，且继代时需要采用适当的方法将细胞和从基质上剥离下来。,三 动物细胞培养技术简述,3微载体培养,优点 既可以创造相当大的贴附面积，满足细胞贴壁生长增殖，又由于载体体积小，比重轻，轻度搅拌即可使微粒带动细胞悬浮在培养基中，从而充分发挥悬浮培养的优点。 微载体的特性 对细胞和人体健康无毒害因子；便于细胞附着、伸展和增殖；化学性质稳定，不与培养基成分发生反应；比重轻，质地软便于搅拌操作

17、并使细胞避免磨擦损伤；透明性好，便于在显微镜下观察。,三 动物细胞培养技术简述,4包埋培养,包埋材料主要有：人工合成材料，如聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚丙烯甲酸酯、聚乙烯醇等；糖类，如纤维素、琼脂、海藻酸钙等；蛋白质类，如胶原、明胶、纤维蛋白等。 优点：避免细胞在搅拌中的伤害；便于产品在微囊中浓缩，有人报道，微囊内的抗体浓度可达1250-5300mgl-1；可增大细胞密度至107-108ml-1以上，从而增加了培养效率。,生产用动物细胞的要求,培养技术要求：具有连续生长的能力，目的产物产量高，培养条件易选择控制。,安全性要求：最早的生物制品法规规定，只有从正常组织分离的原代细胞才能用来生产生物制品

18、，如鸡胚细胞、兔肾细胞等。以后放宽至只要是二倍体细胞，即使经多次传代也可用于生产，如WI-38、2BS细胞等，但非二倍体细胞是绝对禁止使用的。,永久细胞系用于生物药物的生产经历了长期的争议和试验后，已被允许用于药物生产。 1986年来源于淋巴瘤病人分离的永久细胞系Namalwa细胞生产的干扰素被批准用于临床，此后，即有许多永久细胞系用于生物药物的生产，如用猴肾细胞系Vero生产狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗。杂交瘤细胞生产OKT3单克隆抗体，并已于1987年批准用于临床排异反应。采用永久传代细胞生产的t-PA、EPO、VIII因子已在临床应用。 使用永久细胞系必须遵守相关法规对细胞株的要求，和对最

19、终产品中残留的DNA量限制指标。,第五节 动物干细胞研究概况,干细胞（stem cell）是一类具有自我复制能力（self-renewing）的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。 根据其发育阶段，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。 根据其分化潜能的大小，可分为： 全能干细胞。它具有形成完整个体的分化潜能，可以无限制地增殖，能分化成成体的200多种细胞类型，从而可以形成任何组织和器官。胚胎干细胞属于此类。 多能干细胞。它具有分化成多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，如间充质干细胞。 定向干细胞。只能向一种或密切相关的细胞类型分化，如造血干细胞和神经干细胞等。,胚胎干细胞,造血干

20、细胞,神经干细胞,间充质干细胞,一. 胚胎干细胞,胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是已知的分化潜能最广的一类干细胞。 胚胎干细胞系建立于1981年。英国剑桥大学的 Evans和 Kaufman，美国加州大学的Martin分别成功地分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞。此后，一系列其它动物的胚胎干细胞相继分离和建系，如金黄地鼠、大鼠、猪、牛、水貂和兔等。 人胚胎干细胞系由Pre于1989年从人畸胎瘤中分离出胚胎干细胞，初步证明人胚胎干细胞系建立的可能性。此后，Thomson、Gearhart和Shmblott于1998年分别报道他们从体外受精的早期胚胎中成功地建立了人胚胎干

21、细胞株。 2000年，澳大利亚的Reubinoff和新加坡的体外受精专家合作，又成功地从人胚泡中建立了两株未分化的人胚胎干细胞，并在体外分化实验中成功地得到了神经干细胞。,胚胎干细胞的生物学特征： a形态学特征 在培养基中，圆形或卵圆形的细胞单层或多层堆积，呈岛状或巢状，细胞界限不清楚；细胞体积小，核大，胞浆少，有一个或多个核仁。 b发育全能性标志 具有发育阶段特异性胚胎抗原（stage-specific embryonic antigen，SSEA）；碱性磷酸酶（AKP）活性较高；OCT-4基因表达，OCT-4基因是一种发育全能性的标志基因；端粒酶活性很高。,胚胎干细胞的应用前景 胚胎干细胞

22、生物学研究的一个重要领域是运用组织工程和基因工程技术，体外对干细胞进行诱导分化，可识别靶基因，发现新基因，并可进一步改造基因，然后用于体内组织缺陷性疾病的细胞替代治疗和基因治疗，为临床应用开拓新途径。这部分研究称为干细胞工程。,二. 造血干细胞,造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）主要存在于红骨髓内，是从胚胎卵黄囊上的血岛细胞增殖、分化并迁移而来。,生物学特性： a. 高度的自我复制能力 HSC的自我复制能力维持至正常机体的生命终结，自我复制率在正常情况下为50%，即分裂后的子代细胞只有半数保持干细胞的特征，另一半离开干细胞池进入增值分化池。如果两者失去平衡，则

23、会导致病理性造血。 b. 多向分化能力 HSC具有多项分化的潜能，能分化成各种血细胞。 c. 不均一性 HSC不是单一的细胞群体，而是由不同发育阶段的干细胞组成。目前，通过各种技术纯化的HSC在功能、生物物理特征和表面标志上并不完全一致，人们发现这些方法检测出的造血干细胞往往不是处于同一发育阶段。,HSC的研究不仅推动造血理论研究的深入，而且促进了血液病学的发展。研究证明，相当部分的再生障碍性贫血患者HSC的含量低于正常水平，提示HSC数量减少和质量异常是再生障碍性贫血发病机制中的重要因素。目前，HSC的移植已成为治疗血液病的重要手段。 根据HSC的来源不同，HSC的移植可分为骨髓移植、外周干

24、细胞移植、胚胎干细胞移植和脐HSC移植。由于骨髓中含有丰富的HSC，因此骨髓移植是临床上最常用的HSC移植方法，用于治疗一些一般治疗难以奏效、且预后不良的疾病，如再生障碍性贫血、地中海贫血、白血病和急性放射病等。,三. 神经干细胞,近十年的研究表明，在成年哺乳动物的脑组织内不仅存在神经干细胞（neural stem cell），而且还证实这些神经干细胞在细胞因子、激素或环境因素的调控下能在体外分裂，并可进一步分化成神经元或/和胶质细胞。当成年脑组织或脊髓中的神经元或胶质细胞受损后，这些干细胞能够替代，并产生相应的功能。神经干细胞也正是因为它的生物学研究前景和临床应用的巨大潜力，而成为当今神经科学领域研究的热门课题。,神经干细胞通常具有以下特性： 其一，来源于神经系统，能产生神经组织。 其二，有自我更新的能力。