细胞培养和药用化合物的合成.ppt

1、细胞培养与药物的工程生产,1.前言 2.次生代谢产物的生物化学与细胞生物学 2.1异喹啉生物碱合成 2.2萜类吲哚生物碱生物合成 2.3托烷生物碱和烟碱合成 3.细胞培养与次生代谢物的生产 3.1建立高代谢物生产线 3.2器官分化和次生植物产品 3.3生产率的遗传不稳定 4. 逾越屏障：利用分子生物学手段提高植物细胞的次生代谢物产量 4.1克服代谢途径的限速过程 4.2基因的转录调控和整体激活 4.3次生代谢物的定性控制和生物合成目的基因的隔离 4.4次生代谢物的积累和存储 5. 未来展望 6. 结语,高等植物是药用化合物的丰富来源。然而，许多药用植物，由于种植技术上的困难以及经济上的原因，仍

2、然只能从野外获取。药用化合物要求的增加和植物可利用性的大幅减少增加了通过替代途径生产药用化合物的压力，尤其是使用细胞/组织培养和转基因植物。此外，优质原材料的需求也有增加。1970年之前，从细胞培养获得次生代谢物的产量普遍低于那些从植物中获得的产量。然而，一些细胞培养可以有相当大的生产力，并在某些情况下，其产量超过目前一些完整的植物体。目前对于操纵次生代谢产物代谢的分子和细胞生物学进展的了解，为细胞/器官培养和转基因植物中次生代谢物的商业化生产提供了乐观的基础。我们总结了生物碱最近研究取得的进展作为一个主要的模式并讨论控制其生产率和质量的因素，侧重于器官分化，遗传不稳定性，代谢途径的限速酶，基

3、因转录监控机构，次生代谢物的运输和储存。,1前言,高等植物产生多种化学品。迄今已确定超过25,000种萜类，约12,000种生物碱，8000种酚类物质。这些化学物质可在植物中提供多种功能。它们抵御草食动物和病原体，套种的竞争援助，吸引有益生物，如授粉者，并有对于非生物胁迫如紫外线的照射，温度变化，水的状态，和矿质营养的保护作用。此外，许多植物生产的次生代谢产物被用来作为香料，染料，芳香剂，调味剂，或人类的药品。这些化学物质中的许多还可以通过多种不同的方式促进人类健康和丰富我们的生活。,2次生代谢产物的生物化学与细胞生物学,许多植物中的次生代谢产物不仅做为药品，同时也作为膳食补充剂和功能食品促进

4、人类的健康。植物生产的重组蛋白和植物疗法同等重要。由次生代谢产物功能和结构的不同而分为几个主要群体。萜类化合物和类固醇，这是由异戊二烯基团形成，包括抗肿瘤药二萜类紫杉醇；抗疟倍半萜类青蒿素；薯蓣皂甙元，口服避孕药和激素类药物的前体；抗强心剂地高辛甾苷；来至于派生莽草酸途径的苯丙醇；包括抗肿瘤药物木酚素，鬼臼毒素；生物碱是一种含氮的碱性有机化合物，包括许多具有生物活性的化学品如毒芹碱，咖啡因，吗啡，尼古丁，和马钱子碱等。我们这里重点研究生物碱，理由是其具有相对较高的有益的生物活性，尤其是异喹啉生物碱，萜吲哚生物碱，和托烷生物碱，是目前正在深入研究的主题。,1Morphine 吗啡 2Acetyl

5、 salicylic acid乙酰水杨酸 3Artemisinin青蒿素 4Paclitaxel (Taxol) 紫杉醇（泰素） 5Podophyllotoxin鬼臼毒素,2.1异喹啉生物碱合成,异喹啉生物碱是一个庞大和多样化的生物碱约有2500组定义结构。它们包括从罂粟属植物获得的镇痛吗啡，从秋水仙中提取的秋水仙碱，从吐根属吐根中获得的催吐药和依米丁，从马钱子属植物中获得的骨骼肌松弛剂，从小檗碱属和血根碱属植物物种中提取的抗菌化合物筒箭毒碱和黄连素等。其中有许多异喹啉生物碱都是作为药品使用。,异喹啉生物碱合成开始于酪氨酸通过羟化，脱羧，脱氨转化为多巴胺和4- 羟基苯乙醛。在这些早期步骤，只有

6、酪氨酸/多巴脱羧酶，分别把酪氨酸和多巴胺转换成其相应的胺，这种酶已被纯化和修饰。这种小的基因家族已从罂粟中分离而且每个亚科已被证明有明显的发育和诱导表达模式。 TYDC基因家族的成员分为两组（TYDC1和TYDC2），其在罂粟中表达存在差异。在成熟的植物体中，TYDC2在茎和根系中存在，并占主导地位。而TYDC1只在根部存在。,多巴胺和4 - 羟基苯乙醛被NCS（乌药碱合酶）浓缩为（S）norcoclaurine，这是合成所有异喹啉类生物碱的前体。近日，NCS已被从培养的唐松杆菌中纯化和修饰。 研究还表明，从培养的黄连粳稻细胞分离的一种新型加双氧酶也促进NCS的反应。 TYDC（酪氨酸/多巴脱

7、羧酶）、TfNCS和CjNCS在拟南芥或大米中的同源性表明，这些基因或者有其他的基本生物学作用，或者在异喹啉生物合成途径是普遍存在的，即使拟南芥或水稻中TfNCS和CjNCS的同源性相对较低，而且并没有在水稻和拟南芥中发现异喹啉生物碱。STR（异胡豆苷合酶，催化萜类生物碱的关键反应）基因也在动物和拟南芥中被发现。 （S）Norcoclaurine是按顺序地被依赖于S -腺苷蛋氨酸（SAM）的乌药碱6-o-甲基转移酶先转换成乌药碱；再被N 乌药碱甲基转移酶转换为N 甲基乌药碱；然后由细胞色素P450羟化酶转化为3-羟化-N-甲基化乌药碱，最后由3-羟化-N-甲基化乌药碱4- O -甲基转移酶转化

8、生成牛心果碱。详细的研究这些重组酶，发现其有严格的反应特异性，协调生物合成按照一定的方式和顺序进行。,各种异喹啉生物碱生物合成途径。不间断的箭头表明单一的酶转换和断箭表明多种酶的步骤，以粗体显示相应已被克隆的酶基因。,2.2萜类吲哚生物碱生物合成,萜类吲哚生物碱包括约3000种化合物，包括从马达加斯加长春花中获得的抗肿瘤药长春碱，喜树中的喜树碱，并从金鸡纳属植物中获取的抗疟药奎宁。萜类吲哚生物碱生物合成的中间产物是异胡豆苷，这是由异胡豆苷合成酶催化色胺和环烯醚萜葡糖苷开链马钱子甙合成的。色胺是由色氨酸脱羧酶催化色氨酸产生。,催化开链马钱子甙生物合成二个步骤中的酶都依赖于细胞色素P450：香叶醇

9、 10-羟化酶把香叶醇转化为10-羟化香叶醇，而开链马钱子甙合成酶催化马钱子甙转化为开链马钱子甙。萜类化合物的前体的供应是萜吲哚生物碱生物合成的限速步骤，香叶醇10-羟化酶的活性也和生物碱的积累成正相关性。异胡豆苷合成酶是一个萜类生物碱生物合成的关键酶，其cDNA已被从印度萝芙木和长春花中分离。异胡豆苷被异胡豆苷葡糖苷酶去糖基化，然后通过几个不稳定的中间体进行转化。,各种萜吲哚生物碱生物合成途径。不间断的箭头表明单一的酶的转换和虚线箭头表示多种酶的步骤，以粗体显示相应已被克隆的酶基因。,2.3托烷生物碱和烟碱合成,托烷生物碱主要存在于茄科，包括抗胆碱药物阿托品，莨菪碱，东莨菪碱和麻醉药可卡因。

10、腐胺N-甲基是托烷生物碱合成的前体，也是尼古丁合成的中间途径。腐胺N-甲基由鸟氨酸或精氨酸分别在鸟氨酸脱羧酶或精氨酸脱羧酶催化脱羧所生产。托烷生物碱和尼古丁合成与多胺代谢也密切相关。托烷/尼古丁生物碱生物合成的第一个关键步骤是由丁二胺-N-甲基转移酶催化，它与亚精胺合成酶有高度的同源性。甲基腐胺随后由二胺氧化酶脱氨基，然后自发环化反应形成N -甲基- 1-咯啉阳离子。后者被认为给托烷环或烟酸形成尼古丁提供了一个前体，但是具体细节并不清楚。,莨菪酮是托烷生物碱合成的一个分支点。可由两个相关的脱氢酶催化，托品酮还原酶I催化其生成托品碱和托品酮还原酶催化其生成&-托品碱，在烟草樟子松中，尼古丁生物合

11、成的基因被茉莉酸甲酯的外源性应用激活，但这种激活作用有效抑制了乙烯同步处理，即使乙烯和茉莉酸通常被认为是相互协同作用。相比之下用茉莉酸甲酯处理颠茄的根并没有导致颠茄丁二胺-N-甲基转移酶基因的上调表达。托烷生物碱和尼古丁生物合成的不同反应说明了这些生物合成可能由不同的基因调控系统控制。,托烷生物碱，相关的化合物和尼古丁的生物合成途径。不间断的箭头表示单酶转换和断箭头表示多个酶的步骤。以粗体显示相应已被克隆的酶基因。,3.细胞培养与次生代谢物的生产,当我们在体外培养植物细胞时，不同类型的体系生产代谢产物的能力不同。一类代谢产物产生在未分化的细胞的体外培养，而另一类代谢产物产生在培养体系条件差异化

12、的系统中，例如，幼苗或根培养。在某些情况下，细胞在再分化后会失去药用化合物生物合成潜力，即完全丧失其自然的生物合成潜力。例如吗啡烷生物碱不在未分化的罂粟培养体系中生成。而另外几个细胞培养如罂粟和山茶花，产生大量的与异喹啉生物碱结构相关的产品，血根碱和黄连素。有趣的是吗啡，血根碱，黄连素的合成都是通过酪氨酸转化成相同的中间体，牛心果碱，表明在代谢途径的早期步骤并不确定细胞培养的最终产品。,3.1建立高代谢物生产线,虽然一些代谢产物可以在细胞培养系统产生，但建立一个高收益的培养体系是代谢物商业化必不可少的部分，要求培养体系有较高的生产力和稳定性，起始原料应该具有适当的遗传多样性。因此，实证试验需要

13、建立合适的代谢产物生产力细胞株。例如，H.niger是一个良好的植物物种通过细胞培养生产托烷生物碱。但与完整的植株相比，颠茄和曼陀罗细胞培养体系生产代谢物的效率较低。 培养基和培养条件，包括温度、光照、通气等等是重要的因素。其他因素如剪切压力，气体成分，细胞密度也是扩大细胞培养规模的重要条件。例如，黄连素的生产要求更高，因为每个生物合成步骤都需要氧气供应。同样，照明可提高长春花生产萜吲哚生物碱的能力。细胞培养优化条件的机制还没研究清楚，一个详细的生物合成途径表征和调控机制可能有助于了解细胞培养的优化条件。,此外，选择高且稳定的生产代谢产物的细胞是至关重要的。由于植物细胞在开发过程中其套数条件的

14、改变和细胞培养诱导自发突变，选择的细胞应建立一个有效的高代谢物生产线，而且连续的细胞培养常常会导致不稳定性。高而稳定的生产代谢物的细胞培养的维持也很重要，因为培养条件发生微妙的变化可以轻松地改变细胞的表型。一个内源性的因素，对生产效率的影响即是对细胞产生代谢产物可行性的影响。由于许多代谢产物的生物活性，即细胞毒性，这些化学物质的大量积累可诱发细胞死亡或生长发育迟缓，例如，黄连素抑制生产黄连素植物细胞的生长。ABC转运的异位表达避免细胞毒性明确表明，如果细胞缺乏解毒/隔离的机械或耐受体系，代谢产物本身可能是有毒的。虽然稳定的细胞培养所需的重要因素尚未确定，我们的经验表明，生长缓慢的细胞更稳定。这

15、可能是由于生长缓慢的细胞存在低的分裂和突变频率，以及主要代谢产物与细胞生长和次生代谢物之间的竞争较少，观察的结果是细胞生长和生物碱产量之间往往呈负相关性的。,3.2器官分化和次生植物产品,对于第二种情况，代谢产物的产生在器官分化的过程中，植物器官培养是一种大规模的合适替代。土壤农杆菌转化的毛状根，也已发现适合生产次生代谢产物，由于其在无激素的培养条件下稳定，生产效率高。还有几个药用植物物种也成功地以这种方式进行了转变。虽然这种类型的代谢产物生产体系提供了稳定的材料和一个有趣的研究领域，但毛状根的形成如何影响代谢产物的机理尚不明确。毛状根系统有一个更复杂的调节水平因为其组织机构和集成转基因的影响

16、。 在高等植物和其它复杂的有机体中，某几个代谢途径能依靠一般的有机体的发展而进行，包括器官，组织，特别是专门细胞的发展。几个次生化合物的生物合成和积累发生在一个生物体发育过程的特定阶段。化合物在器官和组织的合成不一定高水平的积累，例如，托烷生物碱在颠茄属植物根中和尼古丁生物碱在烟草根中生成然后输送到植物地上部分。,对于次生代谢物依赖特定的细胞结构发展到何种程度的机制尚不清楚。罂粟植物有专门负责次生代谢物储存的异形细胞和排泄的乳汁细胞。萜类吲哚和托烷生物碱也需要类似的细胞合作：异甲羟戊酸途径的酶和香叶醇 10-羟化酶产生10羟化香叶醇存在于韧皮部内薄壁细胞中，色氨酸脱羧酶和异胡豆苷合成酶，作用于

17、萜类吲哚生物碱合成途径的早期，存在于表皮细胞中，而长春花朵灵脱乙酰 4-O-羟化酶和长春花朵灵脱乙酰 4-O-乙酰转移酶，作用于合成途径的后期，存在于植物地上部分的异形细胞中。丁二胺-N-甲基转移酶作用于托烷生物碱的合成，存在于在皮层和内皮层细胞中，天仙子胺-6-羟化酶作用于合成的最后一步，存在于根中柱鞘细胞中。这些结果表明，中间体应该驱动反应从开始到结束。为了每个特定的代谢反应，形态分化的细胞需要功能分化。然而，功能和形态分化之间的联系的分子基础目前尚不清楚。事实上，这种观察可以解释为什么生产一些代谢产物需要器官分化。例如，托烷生物碱合成的关键酶天仙子胺-6-羟化酶的过度表达可以提高细胞培养

18、生产东莨菪碱的产量。,3.3生产率的遗传不稳定,生产率损失是工业应用中的一个关键因素。前面提到过维护连续培养的细胞将导致突变的积累。目前，避免生产率突变损失的唯一手段是冷冻保存，尽管一些实证试验表明，反复选择稳定的细胞生产体系可以克服这个问题。事实上，筛选的山茶花细胞显示了完整的18条数目的染色体，而其他细胞系表现出相当不同数目的染色体。需要进一步研究，以确定如何在细胞培养中控制自发突变和后成的遗传修饰。,生物合成活性的波动更频繁地被观察，尤其是在连续传代培养中。举例来说，高生产力的转基因株系中生物碱的积累表现出相当的不稳定，受培养条件的影响较强烈。由于初生代谢和次生代谢相互争夺培养基基质，快

19、速生长的细胞很可能消耗完培养基，以至于在生产次生代谢物时无能源可利用，也就是细胞快速生长但生物碱产量低。细胞的生长和代谢产物的优化是工业化的重要问题。我们特别点到的两个步骤是分别促进细胞培养生长和代谢产物的产量是克服这些制约因素所必需的。 活性波动的另一个原因是代谢产物的输送。我们有时会遇到细胞内代谢产物的变化，这表明代谢也不是一成不变的。最近生物碱的代谢产物喜树碱的剖面分析表明蒽醌类，它可以被认为是植物抗毒素，存在于毛状根和愈伤组织提取物中，不存在于分化的小蛇根草中。这仅仅是一个例子说明分化的植物和毛状根愈伤组织成分的差异。罂粟细胞生产吗啡烷生物碱的生产率低可能由于中间体在苯并啡叮生物碱中被

20、积极输送而不是在吗啡烷生物碱中。一个详细代谢流的分子特性应该是有帮助的而且可以阐明导致生产率较低的机制。,4. 逾越屏障：利用分子生物学手段提高植物细胞的次生代谢物产量,基因工程技术建立后，代谢途径的修改和基因调控次生代谢成为可能。事实上，如果我们能够提高生产率，或通过减少培养时间或增加代谢产物的水平，那么次生代谢产物的工业化生产是比较可行的。此外，或可能通过减少不必要的途径，以改善代谢产物的质量，或引入新的途径，以产生新的化合物，或完全切断某个途径以积累中间体。这种代谢工程将植物细胞修改成为“绿色化学工厂”以获得所需的化合物。在下面的章节中，我们讨论如何用遗传工程可以有助于消除在细胞培养或完

21、整的植物代谢途径的障碍。一个结果表明，改造细胞本身可能有效地克服这些障碍。被根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌转化了的长春花能稳定的生成长春花朵灵，这不是在细胞培养中发现的。这种转化细胞的代谢活动说明生物碱生物合成所需的细胞特异性类型表达不一定在任何情况下都是必要的可能性。,克服植物细胞生产代谢产物局限性的策略 1）预先存在的途径（2）早期的限速步骤过度表达，明确监管和的产生过量的代谢产物（3）建立一个新的分支途径产生新的化合物F和增加库强度（4）减少不需要的途径，以提高代谢流所需的路径（5）转录因子的过度表达同时激活整个生物合成途径（6）生物合成酶基因的突变或表达下调来积累中间途径,4.1克服代谢途

22、径的限速过程,如果我们能确定限速步骤和隔离靶基因，限速酶的过度表达对于所需药物化合物的积累有好处。关键的一点是确定限速步骤。前期的步骤被推测成整个代谢途径的限速步骤，次生代谢产物前期酶简单的过度表达通常没有足够的诱导能力来合成所需的最终产品，由于缺乏足够的后期酶诱导。这些研究表明，整体和综合的调控生物合成途径是至关重要的。 其他研究也旨在通过托烷生物碱和尼古丁的生物合成途径增加通量。因此，烟草的丁二胺-N-甲基转移酶基因在颠茄和樟子松中过度表达。虽然丁二胺-N-甲基转移酶活力在颠茄中增长了3.3倍，观察只有甲基腐胺水平升高，生物碱含量没有增加。转基因植株丁二胺-N-甲基转移酶的过度表达体现在尼

23、古丁含量增加40，而在相同情况下野生型中只有3的增加量。一个途径中的某些步骤可能是限速的，在大多数情况下由于编码基因的过度表达，立刻会露出新的限速步骤。,4.2基因的转录调控和整体激活,由于研究次生代谢生物合成途径存在难度，研究人员孤立了几个一般的生物合成基因并修饰其启动子序列，尤其是花青素的生物合成。花青素生物合成的分子特性是一个成功的转录调控代谢产物的应用程序，也就是说，引进转录调节因子- R和C1在一个异构系统中和最近激活标记方法所取得的成功显示这些方法的高潜力和光明的未来。 ORCA的表达是由茉莉酸诱导。长春花细胞培养中ORCA3的异位表达增加了萜类生物碱合成中异胡豆苷合成酶、色氨酸脱

24、羧酶、P450细胞色素还原酶、长春花朵灵脱乙酰 4-O-羟化酶基因的表达，但不调控香叶醇 10-羟化酶和长春花朵灵脱乙酰 4-O-乙酰转移酶的基因编码。转基因细胞ORCA3的过度表达显著积累了色氨酸和色胺。然而，由于没有检测到萜吲哚生物碱，萜类分支的途径仍然对萜类生物碱生产有限制。虽然ORCA3在调节萜吲哚生物碱生物合成中起着重要的作用，但是它没有足够的能力去调控整个代谢途径。这表明其它的转录因素也参与其中。如上所述，整个代谢途径调控会更复杂，因为新陈代谢的空间和发展一体化的需要。,4.3次生代谢物的定性控制和生物合成目的基因的隔离,为了植物细胞生产次生代谢产物能被成功的工业化应用，代谢产物的

25、数量和质量都必须改进，那就是，控制代谢物的属性是重要的。通过引入一个新基因来创建一个新的分支生产新型化合物是一种修改属性的好方法。为了达到这个目的，至少有两种可能的方法。一种是使用生物技术的方法来生产所需的化合物，也就是完整的设计一个在简单和迅速增长的微生物系统或他们使用的生物转化体系中的生物合成途径的异源表达。重组酶将提供新的催化活动，而在完整的细胞中其活性低，往往使这种评价困难。微生物酶已被证明是有益的生物转化化学品。植物酶更可能作为生物催化剂，虽然他们有相当高的底物特异性，例如，细胞色素P450，开链马钱子甙合酶 。,另一种方法是在一个已经存在的生物合成途径中引入一个新的分支途径。在一个

26、已经存在的途径中创建一个新的分支的重点是引进基质亲和力特异性酶。引进山茶花金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶的cDNA到花菱草细胞后，生物碱的属性完全被改变。说明了山茶花金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶优于华菱草合酶。产物从生成血根碱变成生成非洲防己碱。然而，植物细胞并不总是天生显示一个新的途径，就是一个新引入的途径可以为进一步的酶转化提供底物，并产生了在野生型细胞中未检测到的新化合物。这个结果清楚地表明在通路中引进一个新的分支途径后植物细胞生产发散化学物质的潜力。这一实验结果也表明植物细胞如何使用预先存在的途径得到一个代谢产物的分支途径。这两种情况对于新的功能基因的分离非常重要。,4.3.1特定基

27、因的分离,生物合成酶的可用性对于修改一个给定的合成途径很重要。生物合成酶需要有足够的底物和反应的特异性，或合理的蛋白质工程，我们对这些知识的了解仍然是有限。因此，从特定的细胞中分离目的基因会更实用，虽然我们如何获得可以分离所需酶，cDNA和基因的好材料值得怀疑。然而生物合成的基因通常集中在微生物中，但这种基因不催化次生代谢物的合成。以前选定的高代谢物生产细胞将是很好的分离这种基因和酶的候选人。例如，山茶花高黄连素生产细胞已经被证明对分离这种生物合成基因非常有用，同样油腺细胞也一样。另外，如果我们能分离目标次生代谢的转录因子，那么使用转基因的细胞为起始原料成为可能。其中一个例子是拟南芥过量表达P

28、AP1基因编码一个MYB转录因子。这条线被用来确定一个新基因参与（使用代谢组学和转录的集成）黄酮类化合物的合成。蛋白质组学方法对于通过双向凝胶电泳和内部肽序列检查蛋白质有用。,4.3.2代谢产物的质量控制,简单的代谢产物的组成，是理想的工业生产。生产所需的化合物最简单的方法是在体外重建整个生物合成的过程，如上所述。到目前为止，有相当数量与生物碱生物合成有关的基因已被克隆，并在大肠杆菌或昆虫细胞中表达。虽然微生物细胞储存代谢产物的能力较低，但异种系统对生物转化有用。 一个更有前途的做法是一个非必需途径基因的表达下调。下调使用的反义材料和共抑制已被证明是有效的，因为被薄荷呋喃合成酶cDNA反义转化

29、后的薄荷植物生产的非必需单萜油成分含量不到野生型的一半。,RNA干扰方法最近发展很迅速，使用双链RNA诱导转录后或转录沉默是一种更有效的方法对于修改一个代谢途径以致其关闭。虽然转基因大肠杆菌细胞的反义黄连桥酶RNA在没有中间体牛心果碱时失去生产生物碱的能力，黄连桥酶的双链RNA表达载体的实验明显诱导了牛心果碱的积累并伴随着终产物的减少。实验结果清楚地说明了这种新的方法对于代谢工程很有用和即使代谢途径已经改变植物细胞也能够存储中间体。一个值得注意的问题是靶序列的选择，因为短寡核苷酸基因序列的完全匹配可以有效地导致同源基因沉默。然而，不必要基因的沉默和消除某些特定蛋白质也可以提供一种改变代谢途径的方式。在含有COR（可待因酮还原酶 ） RNAi载体的转基因罂粟中牛心果碱的积累可能会导致基因沉默的效应，而在合成牛心果碱后中断吗啡生物碱合成酶复合体可能参与牛心果碱的积累。,4.4次生代谢物的积累和存储,由于在植物细胞中产生的次生代谢产物，具有很高的生物活动，他们对于植物细胞本身而言有潜在的毒性。然而，代谢产物的细胞可以在没有受到严重破坏的基本代谢过程中成长。生物碱积累的监管机制