柠檬酸发酵工艺1.ppt

1、第一章 柠檬酸发酵工艺学,三、黑曲霉柠檬酸生产菌的保藏方法,1、斜面低温保藏法 2、载体吸附保藏法 3、真空冷冻干燥保藏法 4、液氮超低温（-196）保藏法,是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。 黑曲霉在pH为23的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很低。,2.1 概述 2.2 黑曲霉柠檬酸生产菌的选育及保藏 2.3 柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺 2.4 柠檬酸的提取和精制 2.5 柠檬酸的质量标准及新工艺新技术,2.3 柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺条件,第一

2、节 柠檬酸发酵机制,一、柠檬酸生物合成途径 1、黑曲霉柠檬酸生物合成途径 葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。,糖酵解途径 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 6-磷酸果糖 1,6-二磷酸果糖 磷酸二羟丙酮+3-磷酸甘油醛 磷酸二羟丙酮 3-磷酸甘油醛 1,3-二磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸+ATP 3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸+ATP 激酶凡是催化磷酰基键ATP分子转移到受体上的酶，都称为激酶,HMP途径 6-磷酸葡萄糖 5-磷酸核酮糖 5-磷酸核糖+5-磷酸木酮

3、糖 6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛 磷酸-D-赤藓糖+5-磷酸木酮糖 6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛,EMP途径在黑曲霉柠檬酸生产菌中起重要作用。 研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶系，证明黑曲霉中存在三羧酸循环。 研究证实，CO2固定反应对柠檬酸积累具有重要的生理意义。 黑曲霉CO2固定中，存在两个CO2固定系统 丙酮酸草酰乙酸Keq=0.818 磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸，Keq=0.049 可见，黑曲霉柠檬酸生产菌中CO2固定反应主要是丙酮酸羧化酶催化的，黑曲霉中已提纯出此酶。,柠檬酸生物合成途径,三羧酸循环概要,2、酵母柠檬酸生物合成途径 解脂假丝酵母能利用烷烃、乙醇、乙酸发酵生成柠檬酸。,

4、酵母（烷烃）柠檬酸生物合成途径,异柠檬酸裂解酶切割异柠檬酸 产生乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸经苹果酸合成酶催化， 在水的存在下接受乙酰辅酶A的乙酸， 生成苹果酸。,NAD+ :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化态） NADH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原态） NADP+ :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化态） NADPH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原态） NAD+ + H+ + 2e- = NADH NADP+ + H+ + 2e- = NADPH 辅酶，用来实现电子传递,二、黑曲霉柠檬酸发酵的代谢控制,1、黑曲霉柠檬酸积累的代谢调节 第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK酶） 柠檬酸、ATP对该酶有抑制作用

5、： 生产菌需要解除该抑制 AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用 实验表明，NH4+能有效的解除柠檬酸、ATP对该酶的抑制作用 因此，生产上添加铵盐来增加柠檬酸产量 Mn2+的影响： Mn2+缺乏菌体TCA酶活下降 Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解 减少柠檬酸对该酶的抑制NH4+水平升高,第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应 研究证实，柠檬酸的生成速度与CO2固定量有化学计量关系， CO2固定主要是丙酮酸羧化酶催化的，生成了草酰乙酸。 第三个调节点：TCA环上的调节 柠檬酸合成酶，是一种调节酶，但在黑曲霉中没有调节作用 顺乌头酸水合酶、异柠檬酸酶 pH2.0时

6、，失活 阻断TCA循环 柠檬酸合成酶活性很高时 积累柠檬酸 顺乌头酸水合酶需要Fe2+ 在发酵液中添加黄血盐，络合Fe2+阻断TCA循环，积累柠檬酸 黑曲霉除正常呼吸链（产生ATP）之外，还存在一条侧呼吸链（不产生ATP） 缺氧对侧呼吸链的损伤是不可逆的，因才在产酸阶段，一定要保证足够的溶氧供应。,三、 黑曲霉柠檬酸的发酵机制归纳,由于严格限制供给锰离子，筛选出耐高浓度金属离子的菌株，使细胞中形成高水平的铵离子，从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增大。 存在一条呼吸性强的侧系呼吸链，不产生ATP，缺氧则呼吸链失活，细胞内ATP浓度下降，减轻了ATP对PFK酶的抑

7、制，促使EMP途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成。 丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和草酰乙酸的供给，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能力。,-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖（蔗糖）和铵离子阻遏，使黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环，降低细胞内ATP浓度，另外使-酮戊二酸浓度升高，又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解。 顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸：=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬酸分解活力低。一旦柠檬酸浓度升高到某一水平

8、，就抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从而进一步促使柠檬酸的自身积累，pH降至2.0以下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累并排出体外。,柠檬酸食用小贴士 常饮酸牛奶：酸奶中含有的乳酸及其它一些有机酸如柠檬酸、葡配合酸等，其稀释液还具有明显的杀菌和防腐作用，被誉为粘膜组织的“清洗剂”，它有助于软化皮肤的粘性表层，去掉死去的旧细胞，在此过程中，皱纹也随之消除了。 吃水果减肥，是不少女性最喜欢使用的方法之一。每100克柠檬中只含24卡路里热量。柠檬中的柠檬酸能促进热量代谢，而且它的维生素C含量是水果中的佼佼者，美白效果好，热量又低，爱美想瘦的女性可适量食用，但避免空腹吃。其它如荔枝，

9、桔子，葡萄等都是富含柠檬酸的佳品。 白癫风患者不能服用含柠檬酸一类的酸的东西。,第二节 柠檬酸发酵原料 工业上考虑因素：经济、技术、货源、易得、易运、易贮、易管、不易霉变、可利用物质含量高、综合利用价值高、无毒、无害、无抑制微生物生长的物质、对产品卫生安全可靠、三废负荷少。 1、糖类 薯类：甘薯、木薯、马铃薯、甘薯干、木薯干、马铃薯干、薯渣 谷类：玉米、小麦或小麦面粉、大米 淀粉：各种谷类、薯类等加工成的淀粉 砂糖：白砂糖、赤砂糖、糖蜜 淀粉糖：由淀粉水解得到的各种单糖、双糖、糊精、饴糖、葡萄糖母液,2、正烷烃 液体石蜡：1020碳链的石油馏出物 3、其他 果实下脚料：葡萄、菠萝、柑橘、苹果等

10、果实加工的残渣、残汁 粮食加工下脚料,第三节 柠檬酸深层发酵工艺,为延长黑曲霉作用时间，采用二次发酵工艺 第一次固体发酵培养基接种黑曲霉（30静止培养3d）第一次发酵 加适量麸皮、尿素及等量酱渣接种白地霉、酵母菌（30静止培养）第二次发酵。,柠檬酸深层发酵工艺流程,深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。现多采用通用发酵罐。 它的主要部件： 罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。 发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。,培养基制备： （1）种子罐培养基及培养：甘薯干粉1620%，(NH4)2SO40.5

11、%，0.1MPa蒸汽灭菌30min，接入1000ml三角瓶麸曲菌种，351培养1624小时，发酵罐的接种量为10%。 （2）发酵培养基：甘薯干粉1620%，0.1%中温-淀粉酶115灭菌1015min，玉米粉采用高温-淀粉酶二次喷射液化，液化后过滤除渣，应控制并调配其发酵培养基中蛋白质含量为0.20.4%,一、营养要求 根据柠檬酸发酵机制，黑曲霉能够大量积累柠檬酸的条件，提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，对磷、锰、铁、锌等无机盐物质处于低水平。 1、碳源：葡萄糖、蔗糖、糊精 为了降低成本，工业上：甘薯、玉米、小麦及其淀粉、糖蜜等。 高糖浓度是柠檬酸发酵的一大特征：薯干粉的深层发酵，粉浆浓度16%2

12、0%，淀粉质深层发酵，粉浆浓度达25% 2、氮源（合成细胞质和调节代谢） 生理酸性氮 (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, NH4Cl, (NH4)2CO3等，调节代谢，控制pH 生理碱性氮 NaNO3, KNO3, LiNO3, Ca(NO3)2, Mg(NO3)2等 两性氮 NH4NO3 有机氮 麸皮，米糠，蛋白胨，氨基酸，尿素等,玉米原料特点,1、玉米淀粉,2、玉米蛋白质,玉米粉的蛋白质含量较高，达9.3%，属于醇溶朊、谷朊、球朊等。其中醇溶朊是玉米蛋白质的主要成分，它占玉米蛋白质总量的40%，加热后凝固。玉米蛋白质对柠檬酸发酵具有双重作用：一是节省柠檬酸发

13、酵所需氮源；二是与戊聚糖、色素等胶体杂质一起影响后道发酵及提取收率。因此，原料预处理过程中通过中和、过滤去除这部分杂质对柠檬酸生产的后道发酵、提取是必要的。,3、玉米中脂肪,3、无机盐 在柠檬酸发酵中，无机盐有的构成菌体，有的促进代谢，有的促进产酸，对黑曲霉的生长和柠檬酸发酵有重要作用,二、温度控制 黑曲霉属嗜热微生物，最适生长温度3337 37 菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸 一般控制在（351） 孢子发芽和菌球体形成阶段，可采用40 高温培养，促进其发育 三、pH控制 适宜pH37。在发酵过程中，原料糖化和产酸过程在同一个环境中，发酵技术的关键是要保

14、证糖化速度和产酸速度之间的衔接与平衡。 黑曲霉柠檬酸生产菌的酸性糖化酶最适pH4.04.6 柠檬酸发酵最适pH2.0以下 解决办法：采用酸性平板驯化，分离在高柠檬酸浓度下糖化酶活力高的菌株；通过调节风量来控制，在1618h前控制低风量，使pH维持在有利于菌株生长和糖化作用的范围。,1、最适温度的选择 在生长阶段，应选择最适生长温度； 在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。 发酵温度可根据不同菌种、不同产品进行选择 2、温度的控制 工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多。 利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层，通过热交

15、换来降温，保持恒温发酵。 如果气温较高（特别是我国南方的夏季气温），冷却水的温度又高，致使冷却效果很差，达不到预定的温度，就可采用冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适温度。因此大工厂需要建立冷冻站，提高冷却能力，以保证在正常温度下进行发酵。,二、 发酵温度为351,三、pH值控制,（1）pH值对发酵的影响 影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢； 影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而影响微生物对这些成分的吸收； pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例

16、发生改变。,（2）发酵过程pH值的变化 在发酵过程中，随着菌种对培养基 碳、氮源的利用，随着有机酸和氨基酸的积累，会使pH值产生一定的变化。 生长阶段：菌体产生蛋白酶,水解培养基中的蛋白质，生成NH4+，使pH上升至碱性；随着菌体量增多， NH4+的消耗也增多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。 生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。 自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体趋于自溶而代谢活动终止，菌体内活跃的蛋白酶和氨基氮进入培养液中，致使pH又上升。,pH值,培养时间,培养过程中培养液pH值的大致变化趋势,由此可见，在适合于菌生长及合成产物的环境条件下，菌体本身具有一定的调节pH的能力，但是当外

17、界条件变化过于剧烈，菌体就失去了调节能力，培养液的pH就会波动。,（3）引起发酵液pH值异常波动的因素 pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件 A)、pH下降： 培养基中碳、氮比例不当。碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加上溶氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降； 消泡剂加得过多； 生理酸性物质的存在，铵被利用，pH下降。 B)、pH上升： 培养基中碳、氮比例不当。氮源过多，氨基氮释放，使pH上升； 生理碱性物质存在； 中间补料氨水或尿素等碱性物质加入过多。,（4）发酵pH值的确定和控制,发酵pH值的确定 微生物发酵的最适pH值范围一般是在58之间。 最适pH值是根据实

18、验结果来确定的。,将发酵培养基调节成不同的出发pH值，进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节pH值，以分别维持出发pH值，或者利用缓冲液来配制培养基来维持。 到时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为菌体生长的合适pH值。 用同样的方法，可测得产物合成的合适pH值。 同一产品的合适pH值，与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。 在确定合适发酵pH值时，要考虑培养温度的影响，若温度升高或降低，合适pH值也可能发生变动。,pH值的控制 首先考虑和试验发酵培养基的基础配方，使碳源和氮源有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。 在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制

19、；补充生理酸性物质（如(NH4)2SO4）和生理碱性物质（如NaNO3）来控制。,（5 ）柠檬酸发酵中开始pH自然5.5 随着菌体生长pH降至2.22.3 随着柠檬酸的大量生成pH迅速降至2.0以下。,四、接种量和接种方式 1、接种量 在一定范围内，孢子接种量与产酸速率成正比，随着孢子接种量的增加，柠檬酸产率也提高。 2、接种方式 在第一代生产种子液中，要用孢子接种（稳定、生理年龄相同）。 在菌丝接种时，选择对数生长期前期的菌丝体 五、溶解氧的控制 产酸速率与溶氧分压成正比。 菌体生长中，有呼吸作用，在对数生长期需氧量达到最高峰 进入产酸期后，氧的消耗降低到一个较低的水平,溶解氧浓度的控制,在

20、供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数。,调节搅拌转速或通气速率来控制供氧； 采用调节温度（降低培养温度可提高溶氧浓度）、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺措施，来改善溶氧水平。,柠檬酸发酵通风控制,通风搅拌 是典型好氧发酵，对氧十分敏感，当发酵进入产酸期时只要有进几分钟的缺氧，就会对发酵造成严重影响，甚至完全失败。,六、菌体浓度和基质对发酵的影响及其控制,1、菌体浓度对发酵的影响及控制,菌体（细胞）浓度【简称菌浓】是指单位体积培养液中菌体的含量。 菌浓的大小，在一定条件下，不仅反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞生理特性不同的分化阶段。,依靠调节培养基的浓度来控制

21、菌浓。,首先确定基础培养基配方中的配比，避免产生过浓（或过稀）的菌体量。 然后通过中间补料来控制，如当菌体生长缓慢、菌浓太稀时，则可补加一部分磷酸盐，促进生长，提高菌浓；但补加过多，则会使菌体过分生长，超过临界浓度，对产物合成产生抑制作用。,利用菌体代谢产生的CO2量来控制生产过程的补糖量，以控制菌体的生长和浓度。,2、基质对发酵的影响及控制,基质即培养微生物的营养物质。,（1）. 碳源对发酵的影响及控制,迅速利用的碳源 缓慢利用的碳源,葡萄糖、蔗糖等 迅速参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解产物，有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用；,多数为聚合物，淀粉等 为菌

22、体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期，也有许多微生物的药物发酵所采用。,在工业上，发酵培养基中常采用含迅速和缓慢利用的混合碳源。,（2）. 氮源对发酵的影响及控制,迅速利用的氮源 缓慢利用的氮源,氨基（或铵）态氮的氨基酸（或硫酸铵等）、玉米浆 容易被菌体利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。,延长代谢产物的分泌期、提高产物的产量；但一次投入也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶，缩短产物的分泌期。,发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用的混合氮源，还要在发酵过程中补加氮源来控制浓度。,补加有机氮源，

23、如酵母汁、玉米浆、尿素 补加无机氮源，如氨水或硫酸铵,（3）. 磷酸盐对发酵的影响及控制,磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的。,微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32300mmol/L， 次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol/L.,柠檬酸发酵终点控制,当通风搅拌培养5072h 柠檬酸产酸达100150g/L，柠檬酸产量不再上升 残糖降至2 g/L以下 可升温终止发酵，泵送至储罐中，及时进行提取。,3.1 薯干原料的发酵工艺,一、生产菌种 Co827、-130和-144、T419等 二、生产工艺条件 1、碳氮比 薯干蛋白质含量6%7%，不需要调

24、节含氮量 木薯干含蛋白质1.7%2.6%，需要用玉米粉、米糠、麸皮等有机氮源和适量无机氮源来补充 2、温度 (371) 3、pH,4、控制生物量 广义的生物量是生物在某一特定时刻单位空间的个体数、重量或其含能量 。 正常发酵液中控制在1020g/L；薯干粗粮发酵，因本身有大量粗纤维，生物量要达到22g/L 生物量过多影响溶氧、增加发酵罐搅拌功率、消耗大量葡萄糖。,5、严防缺氧 柠檬酸发酵是好氧发酵，对氧敏感。 产酸期只要有几分钟的缺氧时间就会造成发酵失败。,6、孢子接种数与菌球体的特征 柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。,菌球体越小、越多，产酸就越高，发